反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知 DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3’端是相互反向 的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母 人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。 該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶 DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探 針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。 利用反向PCR可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。

總結(jié)

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