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编程问答

Illumina输出文件详解

發(fā)布時(shí)間：2023/12/8 编程问答 42 豆豆
生活随笔 收集整理的這篇文章主要介紹了 Illumina输出文件详解 小編覺(jué)得挺不錯(cuò)的,現(xiàn)在分享給大家,幫大家做個(gè)參考.

Illumina輸出文件詳解

    • Illumina測(cè)序原理（next-seq-550）
      • 基本過(guò)程
      • 基本概念
    • BCL文件（Base Call Files）
    • BCI文件（Base Call Index Files）
    • BGZF文件（Block GNU ZIP File）
    • BGZF.BCI（Block Compress Index，可能叫這個(gè)名字）
    • FILTER文件（簇過(guò)濾信息文件）
    • LOCS文件 （簇位置信息文件）
    • Fastq格式文件 （Illumina）

Illumina測(cè)序原理（next-seq-550）

基本過(guò)程

Illumina測(cè)序包裹文庫(kù)制備、簇生成、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析四個(gè)過(guò)程。

  • 文庫(kù)制備：主要是制作一些碎片化的核酸序列，并將這些碎片化的序列和接頭序列連接起來(lái)。接頭序列包括一段與測(cè)序芯片上的寡聚核苷酸（oligo）反向互補(bǔ)的一小段序列，同時(shí)如果需要也可以通過(guò)PCR插入一段index序列用于標(biāo)記序列所屬的樣本。
  • 簇生成：該過(guò)程主要是橋式PCR的過(guò)程。在芯片上有兩種寡聚核苷酸，首先被測(cè)序的單鏈DNA的接頭與其中一種寡聚核苷酸識(shí)別互補(bǔ)，隨后以被測(cè)序的單鏈DNA作為模板合成反向互補(bǔ)的DNA序列。合成完畢以后，進(jìn)行核酸變性，洗去被測(cè)序的單鏈DNA。而后，被合成的DNA序列由于在3‘段的接頭序列中存在與第二種寡聚核苷酸的互補(bǔ)序列，因此可以與第二種寡聚核苷酸序列識(shí)別。識(shí)別以后，會(huì)根據(jù)模板連生成一段反向互補(bǔ)序列。重復(fù)上述過(guò)程，完成簇生成。最后會(huì)切去第二種寡聚核苷酸延伸出的單鏈DNA。
  • 測(cè)序的過(guò)程即加入引物進(jìn)行測(cè)序，核苷酸可以通過(guò)合成發(fā)出的熒光確定。具體原理參考illumina手冊(cè)。雙端測(cè)序則會(huì)在該過(guò)程結(jié)束后重新進(jìn)行橋式PCR并切去第一種寡聚核苷酸延伸的單鏈DNA，并重新執(zhí)行測(cè)序過(guò)程。
  • 數(shù)據(jù)分析過(guò)程，使用illumina專用的Sequencing Analysis Viewer分析生成BCL、圖像等原始文件，再通過(guò)bcl2fastq即可獲得fastq序列并繼續(xù)后續(xù)分析。

基本概念

  • 流動(dòng)槽（flow Cell）：該名稱為Illumina的官方術(shù)語(yǔ)，也稱作芯片，為一次性用品。其表面遍布寡聚核苷酸。
  • 泳道（lane）：一個(gè)流動(dòng)槽有4個(gè)泳道。泳道指帶有專用輸入輸出端口的物理通道。
  • 表面（surface）：流動(dòng)槽會(huì)在頂面和底面兩個(gè)表面成像。一個(gè)小區(qū)的頂面成像后，該小區(qū)的底面會(huì)接著成像，之后會(huì)移至下一個(gè)小區(qū)。
  • 每泳道測(cè)繪帶數(shù)（swaths per lane）：測(cè)繪帶是泳道中的一列小區(qū)。
  • 相機(jī)片段（camera segments）：儀器使用6個(gè)相機(jī)對(duì)流動(dòng)槽成像，為每個(gè)泳道成像3個(gè)片段。
  • 每個(gè)相機(jī)片段的的每測(cè)繪帶小區(qū)數(shù)（tiles per swath per camera segment）：小區(qū)是流動(dòng)槽上的區(qū)域，相機(jī)將其視為一個(gè)圖像。
  • 小區(qū)（tile）：小區(qū)是流動(dòng)槽上以相機(jī)的視野定義的小成像區(qū)域。
流動(dòng)槽組件高輸出中等輸出
泳道44
表面22
每泳道測(cè)繪帶數(shù)31
相機(jī)片段33
每個(gè)相機(jī)片段的每測(cè)繪帶小區(qū)數(shù)1212
成像小區(qū)總計(jì)864（相乘）288（相乘）

注：泳道1和3（泳道對(duì)A）同時(shí)成像。泳道2和4（泳道對(duì)B）再泳道對(duì)A完成后成像。

注：相機(jī)編號(hào)為1-6。相機(jī)1-3對(duì)泳道1成像。相機(jī)4-6對(duì)泳道3成像。對(duì)泳道1和3成像后，成像模塊會(huì)沿x軸方向移動(dòng)，以便對(duì)泳道2和4成像。

BCL文件（Base Call Files）

BCL文件是由Illumina測(cè)序儀生成的測(cè)序文件，包含測(cè)序的信息。包括簇?cái)?shù)和堿基信息。

  • 簇?cái)?shù)：無(wú)符號(hào)32位整數(shù)（unsigned int, 4 Byte）表示。由開(kāi)頭的4個(gè)字節(jié)存儲(chǔ)。
  • 堿基信息：無(wú)符號(hào)8位整數(shù)（unsigned char, 1Byte）表示。低位0-1比特位（bit）表示堿基（00-A，01-C，10-G，11-T），2-7比特表示堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，向右移2位即表示為該堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

注：整數(shù)在內(nèi)存中表示時(shí)從高地址向低地址表示。18 18 AA 08（16進(jìn)制）實(shí)際表示為08 AA 18 18，即需要倒序?yàn)檎鎸?shí)整數(shù)。

注：bit位由左向右為7-0。

例：

地址數(shù)據(jù)（Hex dump）值
0x00000000-0x0000000318 18 AA 08145365016（08AA1818，簇?cái)?shù)）
0x0000000481（1000 0001）01 -> C，1000 00 -> 32
0x0000000580（1000 0000）00 -> A，1000 00 -> 32
0x0000000C55（0101 0101）01 -> C，0101 01 -> 21
0x0000000F3B（0011 1011）11 -> T，0011 10 -> 14
………………

BCI文件（Base Call Index Files）

本文件與bcl.bgzf.bci文件不同。本文件主要表征的是每個(gè)泳道中的每個(gè)小室中簇的數(shù)量，每個(gè)簇即對(duì)應(yīng)一條Read。每條記錄由兩個(gè)無(wú)符號(hào)32位整數(shù)表示。其中低32位標(biāo)識(shí)tile的編號(hào)，高32位標(biāo)識(shí)小室中的簇的數(shù)量。

例：

地址數(shù)據(jù)（Hex dump）值
0x00000000-0x000000075D 2B 00 00 / 35 EE 09 0011101（小室編號(hào)）/ 650805（簇?cái)?shù)量）
0x00000008-0x0000000F5E 2B 00 00 / D8 DF 09 0011102 / 647128
0x00000010-0x000000175F 2B 00 00 / 00 BE 09 0011103 / 638464
0x000006B8-0x000006BF10 5B 00 00 / 60 3A 0A 0023312 / 670304
………………

小室編號(hào)規(guī)則：

  • 表面：1表示頂面，2表示底面
  • 測(cè)繪帶：1、2或3
  • 相機(jī)：1、2、3、4、5或6
  • 小區(qū)：01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12
  • 如：小區(qū)編號(hào)12508表示頂面、測(cè)繪帶2、相機(jī)5和小區(qū)8

BGZF文件（Block GNU ZIP File）

該文件是BCL文件的壓縮文件，壓縮格式為BGZF格式，該格式與gzip格式兼容，可以使用gunzip命令或者7z解壓。該文件實(shí)際上由按照序列排列的GNU ZIP壓縮塊組成，每個(gè)壓縮塊均可表示一個(gè)獨(dú)立的gzip文件。即將gzip文件拼接成1個(gè)文件即是bgzf文件，擁有快速隨機(jī)讀寫(xiě)的能力。每個(gè)gzip壓縮前后均不超過(guò)64KB。

  • 每一個(gè)gzip塊的開(kāi)頭序列為：1F 8B 08 04 00 00 00 00 00 FF 06 00 42 43 02 00；
  • 每一個(gè)gzip塊的結(jié)束序列為：1f 8b 08 04 00 00 00 00 00 ff 06 00 42 43 02 00 1b 00 03 00 00 00 00 00 00 00 00 00；

開(kāi)頭信息為：

主要：

FieldDescriptionTypeValue
ID1gzip IDentifier1uint8_t31
ID2gzip IDentifier2uint8_t139
CMgzip Compression Methoduint8_t8
FLGgzip FLaGsuint8_t4
MTIMEgzip Modification TIMEuint32_t
XFLgzip eXtra FLagsuint8_t
OSgzip Operating Systemuint*_t
XLENgzip eXtra LENgthuint16_t

附加1：

FieldDescriptionTypeValue
SI1Subfield Identifier1uint8_t66
SI2Subfield Identifier2uint8_t67
SLENSubfield LENgthuint16_t2
BSIZEtotal Block SIZE minus 1uint16_t

附加2：

FieldDescriptionTypeValue
CDATACompressed DATA by zlib::deflate()uint8_t[BSIZE-XLEN-19]
CRC32CRC-32uint32_t
ISIZEInput SIZE (length of uncompressed data)uint32_t

本文件的任意壓縮塊均包含上面的全部?jī)?nèi)容。

BGZF.BCI（Block Compress Index，可能叫這個(gè)名字）

需要注意的是這個(gè)文件與bci（Base Call Index Files）文件是不同的，本文件為BGZF壓縮文件的索引文件。但本文件與bci（Base Call Index Files）文件是存在對(duì)應(yīng)關(guān)系的。與bci文件相同的是，本文件的總記錄數(shù)量與bci（Base Call Index Files）文件的記錄數(shù)量是相同的，每一條記錄均表示為一個(gè)小室（Tile）。由頭信息與記錄組成。

需要值得注意且極其重要的是，每一條記錄都對(duì)應(yīng)的都是一個(gè)小室，且每個(gè)小室都由不止一個(gè)gz塊組成。每條記錄的低16位與高48位組成，高48位即本小室開(kāi)始的gz塊在整個(gè)bgzf文件中地址。低16位表示該gz塊解壓后的數(shù)據(jù)塊中本小室開(kāi)始的地址。

如：04 00 / 00 00 00 00 00 00，表示第一小室（如泳道1的編號(hào)11101小室）的起始gz塊的地址在整個(gè)bgzf文件中為0x00 00 00 00 00 00，04表示本小室在第一塊gz塊解壓后的地址0x04開(kāi)始。

如：39 EE / B2 E3 02 00 00 00為第二條記錄，表示第二個(gè)小室的起始gz塊的地址在整個(gè)bgzf文件中為0x00 00 00 02 E3 B2，39 EE表示第二小室在這個(gè)gz塊解壓后的數(shù)據(jù)的地址0xEE 39開(kāi)始。

例：

地址數(shù)據(jù)（Hex dump）值
0x00000000-0x0000000300 00 00 000（頭信息）
0x00000004-0x00000007D8 00 00 00216 （頭信息，小室數(shù)量）
0x00000008-0x0000000F04 00 / 00 00 00 00 00 004 / 0（記錄）
0x00000010-0x0000001739 EE / B2 E3 02 00 00 0060985 / 189362
………………

FILTER文件（簇過(guò)濾信息文件）

本文件主要包含的是每個(gè)簇的是否被過(guò)濾的信息。其中0-12 Byte表示該文件的頭信息，包括頭、版本、簇?cái)?shù)。后面信息則為記錄，每條記錄為1 Byte。

例：

地址數(shù)據(jù)（Hex dump）值
0x00000000-0x0000000300 00 00 000（頭信息）
0x00000004-0x0000000703 00 00 003（文件版本號(hào)）
0x00000008-0x0000000B18 18 AA 08145365016（08AA1818，簇?cái)?shù)）
0x0000000C00False 未通過(guò)過(guò)濾，在Fastq的頭中用Y表示
0x0000013001True 通過(guò)過(guò)濾，在Fastq的頭中用N表示
………………

LOCS文件 （簇位置信息文件）

本文件主要記錄的是每個(gè)簇所在的位置信息。其中0-12 Byte表示該文件的頭信息。后面每8 Byte為一條記錄，每條記錄包括x軸位置信息和y軸位置信息。

例：

地址數(shù)據(jù)（Hex dump）值
0x00000000-0x0000000301 00 00 001 (Uint32) 頭信息
0x00000004-0x0000000700 00 80 3F1.0（Float32）頭信息
0x00000008-0x0000000BEF E1 2F 0236692463（022FE1EF，簇?cái)?shù)）
0x0000000C-0x0000001332 92 5B 43/21 EC 03 40219.57（Float32，x軸坐標(biāo)）/ 2.06 (Float32, y軸坐標(biāo))

坐標(biāo)信息轉(zhuǎn)換到Fastq文件中時(shí)需要進(jìn)行一定的轉(zhuǎn)換，具體轉(zhuǎn)換公式如下：

_pos = (Uint32)record_pos*10+1000.5

Fastq格式文件 （Illumina）

FieldDescription
@每一條記錄的開(kāi)始
instrument設(shè)備號(hào)
run ID系統(tǒng)運(yùn)行編號(hào)
flow cell ID流動(dòng)槽編號(hào)
lane泳道編號(hào)
tile小區(qū)編號(hào)
x_posx軸坐標(biāo)
y_posy軸坐標(biāo)
UMI[Optional] The UMI sequence (A, G, C, T, and N). When the sample sheet specifies UMIs, a plus sign separates the Read 1 and Read 2 sequences.[后接一個(gè)空格]
read1/2分別表示單端或雙端中序列1或序列2，單端測(cè)序僅有1，雙端存在1和2
is filteredY-表示被過(guò)濾，N-表示未被過(guò)濾
control number0—Control bits are not turned on.*
index sequence or sample number[可選]接頭序列或者樣本的編號(hào)

第二行為堿基序列；

第三行為注釋，一般為+；

第四行為質(zhì)量信息，為phred33格式表示。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Illumina输出文件详解的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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