直接用二代測序的技術就ok了。哺乳動物的線粒體基因組最小，果蠅和蛙的稍大，酵母的更大，而植物的線粒體基因組最大。人、小鼠和牛的線粒體基因組全序列已經測定，都是16.5 kb左右。

在 P CR 技術引入線粒體 DNA ( 簡稱 mtDNA )分離以前 ,對于線粒體基因組全序列的測定 ,主要包括以下2 部分內容 : ( 1 )高純度 m t DNA 的獲得 ; ( 2 ) m t DNA 片段化成適于克隆測序的短 DNA 片段 。1 . 1 　 高純度 m t D NA 的獲得高純度 m t DNA 的獲得 ,主要有密度梯度離心法和差速離心法 。 此外 , 還有在此基礎上進行局部優化的方法 ,如 DN a s e法 、 堿變性法和改良的堿變性法等。氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心 ,不事先制備密度梯度 ,而是制備 6 mo l /L 氯化銫溶液 , 待分離的大分子溶解在氯化銫中時 ,置于高離心場中 ,氯化銫開始沉降 ; 經過幾小時后達到平衡 ,形成穩定的氯化銫密度梯度 ,大分子混合物按照顆粒的密度分布 , 在各區帶中被分開 。此法可獲得極高分辨力 , 特別適用于分離不同類型的核酸。 差速離心法差速離心法 ,又稱為分級離心法 ,由 Ta m u r a 和 Ao ts uka 最早建立 , 由于組織勻漿后的混合液中 , 不同組分的質量不同 ,利用在離心力場下沉淀它們的離心力不同的原理將組分分離 。 為了獲得特定的組分 ,通常需要進行一系列的離心 。 首先選擇較低的離心速度和較短的離心時間 ,將不需要的大粒子沉淀去除后 ,再選擇較高的離心速度和較長的離心時間 ,將所需的組分沉淀下來 ,而大多數更小的粒子則留在上清液中。 1 . 2 　 線粒體 DNA 片段化上述方法獲得 m t DNA 通常通過限制性內切酶消化或超聲波隨機打斷的方法 ,片段化為適合克隆測序的短 DNA 片段 。參考公布的線粒體基因組研究通用引物,或通過近源物種的線粒體基因組全序列 , 設計出能覆蓋全基因組的引物 ,采用常規 P CR 技術直接由總 DNA 中對線粒體基因組進行擴增 ,形成一系列長度短于 5 kb的DNA 片段 , 并將其克隆進質粒載體進行測序 。

總結

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