普通PCR過程分為三步：　　1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA　　2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。　　每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理論上）。巢式PCR過程分為兩步：第一步：目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對(duì)引物結(jié)合。第一對(duì)引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。第二步：使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。

我來補(bǔ)充一下吧，說一下兩者的定義。普通PCR:一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：變性：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘。退火：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引子熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的黏合溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會(huì)高于熔點(diǎn)3~5℃，僅需時(shí)間5~10秒。延伸：DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引子開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片斷長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、融合型聚合酶僅約15秒。巢式PCR（nested PCR）：總體步驟與普通的相同，特點(diǎn)是先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴(kuò)增。

巢式PCR雖然也是擴(kuò)增兩次，但是跟普通的二次PCR相比，它的優(yōu)勢(shì)是多方面的。巢式PCR的兩對(duì)引物是嵌套的，即第二對(duì)引物是在第一對(duì)引物往里的。這點(diǎn)區(qū)別產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)很多：能夠提高檢測(cè)的特異性，在巢式過程中往往第一輪的PCR產(chǎn)物跑電泳啥都看不到，但是經(jīng)過第二輪的PCR，產(chǎn)物就很亮了。比如檢測(cè)黃瓜根際真菌，只要一個(gè)孢子，液氮碾磨，做巢式就能檢測(cè)出來。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)是二次PCR所不能媲美的。另外還有一點(diǎn)就是從酶的角度分析，你從3kb的片段上擴(kuò)1kb的序列的效率要比1kb設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增自身高的多得多。聚合酶起作用的時(shí)候同樣需要擴(kuò)增起始位點(diǎn)的上游有一段序列，方便結(jié)合。所以說，巢式PCR在檢測(cè)中的檢測(cè)限要比二次PCR低的低得多，要更加靈敏。尤其是樣品中目的序列的豐度較低的情況下，巢式PCR的優(yōu)勢(shì)就展現(xiàn)出來了。

巢式PCR相對(duì)普通PCR,其優(yōu)點(diǎn)是：1、克服了單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；2、由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；3、內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因引可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的巢氏PCR和普通PCR有什么区别？的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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