編譯作者：濟滄海（brainnews 創作團隊），校審：Simon（brainnews 編輯部）

　　動物在運動時，如果能通過光記錄帶有基因標記的單個神經元電活動，將極大地有助于人們理解神經系統是如何處理信息的。

　　基因編碼的熒光電壓指示劑(GEVIs)可以展示神經元非尖峰的電活動，并以亞毫秒級的分辨率解決尖峰計時問題，而這是基因編碼的熒光鈣離子指示劑(GECIs)無法完成的任務。

　　多光子顯微鏡，通過選擇性地激發聚焦點內的熒光，抑制了背景熒光的產生，在更深處腦區比單光子顯微鏡更能分離細胞之間的信號，因此對大腦許多區域的熒光成像至關重要。

　　然而，GEVIs 和多光子顯微鏡的獨特功能還沒有被用于記錄哺乳動物大腦中單個神經元的電壓。事實上，快速多光子電壓記錄被認為是非常困難或不切實際的。GECIs 的多光子記錄通常是通過光柵以采樣率≤30Hz 掃描整個平面，適用于檢測持續數百毫秒的鈣瞬變。如果 GEVIs 能夠足夠快地跟蹤由胞體產生的尖峰，或者只持續幾毫秒的動作電位(APs)，則需要更快1-2 個數量級的采樣率。如果光柵掃描速度加快，則需要增加激光功率以保持每個體素的光子通量。此外，由于 GEVI 駐留在膜上而不是在細胞質中，所以光學切片中的 GEVI 分子數量通常比 GECIs 少，這減少了每個神經元的綜合信號。

　　基于以上這些因素可以預測，多光子電壓成像需要非常高的照明功率，而這又會導致快速的光損傷和光漂白。在這些約束條件下，開發更大響應性和更優動力學的 GEVIs 對于最大限度地檢測神經元電活動是至關重要的。

　　2019 年 12 月 12 日，來自斯坦福大學的 Ste´ phane Dieudonne´和 Michael Z. Lin 課題組在Cell上發表了題為“Ultrafast Two-Photon Imaging of a High-Gain Voltage Indicator in Awake Behaving Mice”的文章。該文章報告了一個基因編碼的熒光電壓指示劑ASAP3，其 51% 的熒光可由生理電壓調制，具有亞毫秒的激活動力學，并在雙光子激發下完全響應。

　　文章還介紹了一種超快局部體積激發(ULoVE)方法，用于雙光子采樣，提高了穩定性和靈敏度。結合 ASAP3 和 ULoVE，作者在深部腦區對尖峰和閾下電活動進行追蹤，發現其具有亞細胞分辨率并且可以在幾天內重復采樣。同時發現在視覺皮層，運動可導致細胞類型依賴的閾下電壓調制。因此，結合 ASAP3 和 ULoVE，可在清醒狀態下的深部腦區高速地光記錄轉基因神經元的電活動。

　　目前，對閾下電壓變化和動作電位響應最大的 GEVIs 是基于兩個電壓感知結構域而開發的：七個跨膜螺旋視蛋白和四個跨膜螺旋電壓感知域(VSDs)。基于視蛋白而開發的 GEVIs 已被用于報告由單光子激發的在體淺表神經元電活動，但其響應性在雙光子激發下嚴重減弱。

　　相反，ASAP 家族的 GEVIs，由插入G. gallus電壓感應磷酸酶的第四跨膜螺旋 VSD 中的循環排列的 GFP (cpGFP)變體組成，可以完全響應雙光子的激發。特別是，ASAP2s 是基于熒光蛋白的 GEVIs，可以最大響應每個動作電位，盡管其動力學比早期的 ASAP 變異體慢。因此作者想篩選到更優化的 ASAP 變異體。

　　文章中作者通過 PCR 快速生成 ASAP 變異體的基因文庫，并將 PCR 產物電轉到哺乳動物細胞中，根據細胞的熒光亮度自動化篩選到改進了的電壓指示劑 ASAP3。ASAP3 在單光子或雙光子激發下對穩態電壓或動作電位的響應最大，對動作電位計時和檢測都有良好的動力學，并且能有效地定位在膜上。

　　此外，作者還介紹了一種超快速局部體積激發(ULoVE)策略用于雙光子顯微鏡。實驗中以高達每體積 20kHz 的功率選擇性地激發膜區。作者發現第三種激發模式，即將光分散成 9 照射點，ASAP3-Kv 的光漂白比較溫和，在連續以 2 - 4 kHz 記錄時，前 10s 熒光損失 19.6%±4.5%，之后緩慢下降，在接下來的 5 分鐘內以每分鐘 0.99%±0.75% 的速率光漂白，這比一個衍射激發點高近 50 倍的耐光性。因此，ULoVE 可以通過縮短激發的停留時間或多點分散激發能量以減少光漂白。

　　接著，作者將 ASAP3-Kv 和 ULoVE 雙光子顯微鏡在小鼠體內驗證其特殊的功能，發現 ASAP3 和 ULoVE 顯微鏡實現了 GEVIs 的多個理論優勢，即比基于單光子的方法能夠報告多位置、亞細胞位置和更深腦區的閾下和尖峰電活動，并且可以持續多天檢測神經元電活動。

　　作者還檢測了 ASAP3-Kv 是否可以同時報告同一個神經元的電壓振蕩和動作電位，這代表突觸功能的輸入和輸出。腦電振蕩被廣泛認為是大腦狀態的標志，協調神經回路的信息處理。作者發現小鼠運動時，海馬神經元中的 ASAP3-Kv 信號表現出較強的θ波振蕩。另外，每一個振蕩頻率都與中間神經元的活動有關，GEVIs 提供了將細胞類型的活性與腦電振蕩相關聯的可能性。在 PV 陽性表達 Cre 重組酶的轉基因小鼠海馬中注射了具有 Cre 依賴 ASAP3-Kv AAV，可以觀察 PV 神經元在小鼠運動時的電壓變化。

　　最后，作者還檢測了小鼠運動時對單個神經元電活動的調制情況，發現小鼠在休息或運動時，根據電信號特征假定是中間神經元動作電位的周圍 400 毫秒的膜電位沒有差異。相反，電壓叢發性細胞（bursty cells）在小鼠運動時動作電位周圍的去極化電位明顯高于休息時的電位。該結果與先前運動誘發閾下去極化的電生理學結果一致。總之，實驗結果證實了光電壓記錄 ASAP3-Kv 能夠捕獲特定細胞類型的尖峰電活動和閾下電壓動態調制。

　　我們期待這個基因編碼的熒光電壓指示劑ASAP3進一步普及和應用！

總結

以上是生活随笔為你收集整理的Cell重磅：可基因编码的光记录电压探针！的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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