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Richard Young教授，美國科學(xué)院院士，就職于Whitehead研究所，是基因轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控研究的先驅(qū)，做出了很多開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。

2013年關(guān)于超級增強(qiáng)子的研究，引燃了這個領(lǐng)域。超級增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)看上去是偶然，但遍歷其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的研究，這個發(fā)現(xiàn)又是必然，是知識積累到一定程度，融匯貫通的結(jié)果。

也許我們在處理高通量數(shù)據(jù)的過程中，也發(fā)現(xiàn)過類似的區(qū)域，但因為不敏感或不確信，更多的是因為沒有足夠的知識積淀來解釋這個現(xiàn)象存在的原因或意義，導(dǎo)致我們與大發(fā)現(xiàn)失之交臂。

超級增強(qiáng)子發(fā)現(xiàn)的那一年，有幸遇到Richard Young教授，就請教了下為啥會起這個名字，Young教授說，看到這個區(qū)域了，為了方便研究就隨便給了個名字。看來會起名字，是科學(xué)研究的第一步。要不然叫著都不順口，怎么去跟導(dǎo)師交流，怎么能讓人記住，讓自己記住。

當(dāng)然這只是大牛的謙虛，人家起這個名字是因為看得遠(yuǎn)，一語道出了重要作用。

接下來我們捋一捋大牛10年間做過的研究，跟隨大牛的腳步，去學(xué)下如何做數(shù)據(jù)分析。

2000年發(fā)明 ChIP-chip，鑒定了Gal4和Ste12的結(jié)合圖譜，并結(jié)合不同生長條件下的轉(zhuǎn)錄圖譜，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析。這篇文章，放在現(xiàn)在，也很具有參考意義。

這是華人大牛任兵教授在Richard Young教授做博后時的重要產(chǎn)出之一。

2002年，擴(kuò)大樣本量，整合分析106個調(diào)控因子的結(jié)合圖譜。構(gòu)建了106個調(diào)控因子與2343個基因之間的4000多調(diào)控結(jié)合關(guān)系，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò) (網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建)，發(fā)現(xiàn)調(diào)控因子之間存在較強(qiáng)的互調(diào)控關(guān)系。

2004年綜合結(jié)合圖譜、Motif分析、序列保守性揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)代碼，即轉(zhuǎn)錄因子在啟動子區(qū)的結(jié)合模式及其在不同環(huán)境下的調(diào)控變化。(現(xiàn)在做motif分析，也無外乎這些)

這樣就把轉(zhuǎn)錄因子的分析工作能做的都做了，下面就到了組蛋白修飾方面。

2008年，活性啟動子區(qū)的雙向轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄延伸與H3K79me2相關(guān)。

2010年，承接上面的工作，發(fā)現(xiàn)cMyc調(diào)節(jié)Pol II啟動轉(zhuǎn)錄延伸。在人胚胎干細(xì)胞中，約30%的基因有轉(zhuǎn)錄起始進(jìn)程，卻檢測不到轉(zhuǎn)錄延伸。轉(zhuǎn)錄復(fù)合體招募形成后不會立即轉(zhuǎn)錄，而是在啟動子近端停留；轉(zhuǎn)錄因子cMyc則發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體運轉(zhuǎn)的作用。

這篇文章也是研究的一個很好的范例，首先確認(rèn)是不是 (轉(zhuǎn)錄起始和延伸不成比例)，然后看誰參與 (關(guān)聯(lián)不同轉(zhuǎn)錄因子，這里有個背景是cMyc與之前發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄釋放因子PTEFb存在互作)，然后多方證據(jù)證明cMyc確實與POL II的釋放有關(guān) (這里選取的對照、和采用的計量方式都值得借鑒)。最后干擾下，確實有效果。完美結(jié)束故事。

當(dāng)然關(guān)于cMyc的研究卻沒結(jié)束，2012年有一篇cell，發(fā)現(xiàn)cMyc可以引起腫瘤細(xì)胞中整體轉(zhuǎn)錄水平升高。(注意：cMyc腫瘤中絕大部分活性基因的增量表達(dá)，做腫瘤轉(zhuǎn)錄組時，嚴(yán)格一些記得要加spike-in，不然相對定量就容易把差異抹去了)

還是2010年，發(fā)現(xiàn)Mediator和cohesin可以通過介導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Mediator很關(guān)鍵，也是后面發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子的一個功臣。

大規(guī)模shRNA篩選哪些基因的敲除對多能性基因的表達(dá)影響最大。

從結(jié)合圖譜確認(rèn)Mediator和cohesin敲低后，影響基因表達(dá)的機(jī)理。后續(xù)有3C實驗驗證染色體結(jié)構(gòu)確實發(fā)生了變化。

2013年發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子 (super enhancer)，成簇的增強(qiáng)子。最開始定義是：Oct4，Sox，Nanog共結(jié)合的區(qū)域包含成簇的增強(qiáng)子定義為超級增強(qiáng)子，其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度和敏感性都更高。

后來關(guān)聯(lián)到上一篇工作提到的Mediator：Med1的結(jié)合強(qiáng)度把增強(qiáng)子分成2類，大約40%的Med1信號出現(xiàn)在231個大的增強(qiáng)子上。這個關(guān)聯(lián)就成了超級增強(qiáng)子鑒定的一個依據(jù)。

隨后是超級增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)特征和功能分析，這個GSEA圖很有意思，充分利用上一篇文章中的大規(guī)模敲除結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子調(diào)控的基因富集與對多能性因子影響最強(qiáng)的基因中，定格了超級增強(qiáng)子的重要功能。GSEA還不會，看這里。

超級增強(qiáng)子的富集峰圖很有意思，平常見多了Gene body區(qū)域的富集，習(xí)慣了有高有低的分布。而超級增強(qiáng)子內(nèi)TF的結(jié)合分布均一，這個圖咋一看上去沒什么特色，而這個沒特色作者卻能解釋成很重要的特色，是很好的看問題視角。區(qū)域內(nèi)怎么分布沒關(guān)系，反正是普遍高，高于兩端區(qū)域，就是好的現(xiàn)象。

關(guān)聯(lián)完轉(zhuǎn)錄因子，再關(guān)聯(lián)組蛋白修飾，畢竟轉(zhuǎn)錄組因子數(shù)據(jù)少，又有細(xì)胞特異性，不適合用于大規(guī)模鑒定，發(fā)現(xiàn)H3K27ac可以標(biāo)記超級增強(qiáng)子，并有細(xì)胞特異性。再刷一波cell。

來一張圖，檢驗下做調(diào)控的你知識儲備是否足夠，看看這些調(diào)控元件知道多少？如果都不知道，怎么能談得上活學(xué)活用、關(guān)聯(lián)分析呢？

Richard Young教授的文章還有很多，這里選了一部分表觀調(diào)控為主的文章，其在胚胎干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、miRNA調(diào)控等領(lǐng)域都有很多好工作，每一篇文章都值得拿過來掰開了慢慢看。也許看的多了，可以從中看出大牛思考的蛛絲馬跡，給自己的科研加一些助力。后臺回復(fù) RA獲取文章全文和采訪視頻。想重復(fù)文章的圖，參考之前發(fā)布的ChIP-seq基本分析流程，和我們的視頻課 https://ke.qq.com/course/291881。

超級增強(qiáng)子鑒定代碼

這個是基于super-enhancer的文章描述和Richard Young教授實驗室發(fā)表的ROSE軟件，制作的一個簡化版，也是我們在本期ChIP-seq培訓(xùn)時大家一起討論出來的解決方式，發(fā)布出來，供大家批評指教。線下集訓(xùn)是很好的方式，歡迎大家參加正在籌備的二代三代轉(zhuǎn)錄組測序分析實戰(zhàn)班。

這個流程沒有考慮鑒定出的增強(qiáng)子與基因區(qū)的關(guān)系，另外流程稍作修改，可用于鑒定各種超級圖譜，如超級TF結(jié)合，超級組蛋白修飾結(jié)合，都可以。

組成型增強(qiáng)子排序

bedtools sort -i mm10.enhancer.bed >mm10.enhancer.sort.bed

距離在12.5 kb內(nèi)的增強(qiáng)子歸為一簇

bedtools cluster -d 125000 -i mm10.enhancer.sort.bed >mm10.cluster.enhancer.bed

計算每個增強(qiáng)子的H3K27ac結(jié)合強(qiáng)度

bedtools coverage -c -a mm10.cluster.enhancer.bed -b MESC_H3K27ac/MESC_H3K27ac.rmdup.bam \

mm10.cluster.enhancer.H3K27ac.profile_tmp

對每簇增強(qiáng)子的結(jié)合強(qiáng)度做簇內(nèi)加和

注意： -g 指定以那一列分組，指定的應(yīng)該是標(biāo)記分簇的數(shù)字所在的列;

-c 表示對coverage所在的列計算加和 (-o sum)，注意列需要根據(jù)實際指定

bedtools groupby -i mm10.cluster.enhancer.H3K27ac.profile_tmp -g 5 -c 6 -o sum \

mm10.cluster.enhancer.H3K27ac.profile
以下為R代碼請在R中運行

以下為R代碼

enhancer = read.table(“mm10.cluster.enhancer.H3K27ac.profile”,
header=F, row.names=NULL, sep=”\t”)
head(enhancer)

注意查看豐度信息是否在第二列，若不在，則需做相應(yīng)修改

H3K27ac = sort(enhancer$V2)

plot(H3K27ac, col=2, type=”l”)

計算拐點, 代碼取自ROSE

numPts_below_line <- function(myVector,slope,x){
yPt <- myVector[x]
b <- yPt-(slope*x)
xPts <- 1:length(myVector)
return(sum(myVector<=(xPts*slope+b)))
}

inputVector <- H3K27ac

set those regions with more control than ranking equal to zero

inputVector[inputVector<0]<-0

This is the slope of the line we want to slide. This is the diagonal.

slope <- (max(inputVector)-min(inputVector))/length(inputVector)

Find the x-axis point where a line passing through that point has the minimum number

of points below it. (ie. tangent)。

該點就是切點

xPt <- floor(optimize(numPts_below_line, lower=1, \
upper=length(inputVector),myVector= inputVector,slope=slope)$minimum)

y_cutoff <- inputVector[xPt] #The y-value at this x point. This is our cutoff.

b <- y_cutoff-(slope* xPt)
abline(v= xPt,h= y_cutoff,lty=2,col=8)
points(xPt,y_cutoff,pch=16,cex=0.9,col=2)
abline(coef=c(b,slope),col=2)
title(paste(“x=”,xPt,”\ny=”,signif(y_cutoff,3),”\nFold over Median=”,
signif(y_cutoff/median(inputVector),3),”x\nFold over Mean=”,
signif(y_cutoff/mean(inputVector),3),”x”,sep=”“))

Number of regions with zero signal

axis(1,sum(inputVector==0),sum(inputVector==0),col.axis=”pink”,col=”pink”)

超級增強(qiáng)子cluster

enhancer[enhancer$V2>=y_cutoff,1]
PYTHONBIOINFO生物信息
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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的从Richard Young教授的系列研究看超级增强子发现背后的故事 (附超级增强子鉴定代码)的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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