蓋玻片是顯微鏡制樣中常用的耗材，但是蓋玻片是有厚度的，它會(huì)對(duì)光線穿行造成一定的改變，從而影響成像的清晰度和亮度。由于絕大部分的物鏡是針對(duì)0.17mm(或者稱為#1.5)蓋玻片進(jìn)行設(shè)計(jì)生產(chǎn)的，因此常規(guī)制樣過程中，顯微鏡廠商一般推薦使用厚度為0.17mm的蓋玻片以達(dá)到最佳的成像效果。

但是市面上的蓋玻片耗材多種多樣，厚薄不一(見表1)。除此之外，在倒置顯微鏡上，經(jīng)常會(huì)使用諸如培養(yǎng)皿、多孔板等各種不同類型的耗材，有些器皿的底部厚度甚至達(dá)到了1-2mm。此時(shí)，必須使用帶有校正環(huán)功能的物鏡來進(jìn)行成像。

表1、MatTek公司不同號(hào)碼蓋玻片及其對(duì)應(yīng)的實(shí)際厚度

在倒置顯微鏡中，經(jīng)常需要配置長(zhǎng)工作距離物鏡，因?yàn)殚L(zhǎng)工作距離物鏡不僅能用于載玻片觀察，還能兼容不同底部厚度的器皿，進(jìn)行活細(xì)胞觀察。在長(zhǎng)工作距離物鏡上，我們經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)有一圈能左右轉(zhuǎn)動(dòng)的校正環(huán)(圖1)。針對(duì)不同厚度的耗材，我們需要將校正環(huán)調(diào)節(jié)到不同位置。

圖1、帶校正環(huán)的20倍和63倍物鏡。英文簡(jiǎn)寫CORR代表此物鏡帶有校環(huán)，校正環(huán)可以左右轉(zhuǎn)動(dòng)，將環(huán)上的小點(diǎn)位置調(diào)節(jié)至當(dāng)前使用蓋玻片或器皿底部的厚度處。

別小看了這個(gè)校正環(huán)，它對(duì)顯微成像會(huì)產(chǎn)生很大的影響。我們使用0.17mm蓋玻片的樣品進(jìn)行了相應(yīng)測(cè)試。明場(chǎng)成像時(shí)，如果校正環(huán)調(diào)節(jié)位置不對(duì)，成像清晰度會(huì)嚴(yán)重下降，而且是無法通過鏡體調(diào)焦旋鈕來改善的(圖2)。在對(duì)熒光成像時(shí)，校正環(huán)設(shè)置不準(zhǔn)確，除了清晰度下降以外，熒光的亮度也會(huì)發(fā)生大幅下降(圖3)。因此，大家在倒置顯微鏡上觀察時(shí)，記得要確認(rèn)一下物鏡是否帶有校正環(huán)，校正環(huán)的位置調(diào)節(jié)是否正確。

圖2、腎臟病理切片的明場(chǎng)成像。成像物鏡為帶校正環(huán)的40倍物鏡，校正環(huán)位置分別為0(左上)，0.17(右上)，1.0(左下)，2.0mm(右下)。

圖3、Mito-TrackerRed標(biāo)記的線粒體熒光成像。成像物鏡為帶校正環(huán)的63倍物鏡，校正環(huán)位置分別為0.3(上)，0. 7(中)，0.17 mm(下)。

但是，倒置顯微鏡在物鏡轉(zhuǎn)盤處的操作空間狹小，對(duì)于手指粗壯的男同胞來說，伸手進(jìn)去調(diào)節(jié)校正環(huán)稍顯麻煩。特別是在搭載了雙熒光光路和孵育箱的活細(xì)胞工作站上(圖4)，手動(dòng)調(diào)節(jié)校正環(huán)會(huì)變得更加吃力。

圖4、搭載雙熒光光路的DMi8活細(xì)胞工作站(上圖配置的為培養(yǎng)小室，下圖配置的為大型孵育箱)

一直以來，徠卡將人性化設(shè)計(jì)貫穿于所有產(chǎn)品之中。針對(duì)倒置顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)盤處操作空間狹小，手動(dòng)調(diào)節(jié)校正環(huán)困難的問題，徠卡推出了獨(dú)家設(shè)計(jì)的motCORR物鏡，可通過外部旋鈕和LAS X成像軟件，即可對(duì)物鏡校正環(huán)進(jìn)行全電動(dòng)調(diào)節(jié)(圖5)。

圖5、徠卡motCORR物鏡(左)，可通過外部旋鈕(右下)和LAS X成像軟件(右上)進(jìn)行物鏡校正環(huán)全電動(dòng)調(diào)節(jié)。

尤其是在一些高端成像方式中，經(jīng)常需要對(duì)物鏡的校正環(huán)進(jìn)行調(diào)節(jié)(圖6)。motCORR能提供比手動(dòng)調(diào)節(jié)更可靠的參數(shù)設(shè)置，而且更具有可重復(fù)性。

圖6、徠卡motCORR物鏡非常適用的三大應(yīng)用方向：FCS(左)、多光子(中)和活細(xì)胞(右)成像。

如在FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy，熒光相關(guān)光譜)成像時(shí)，通過motCORR可輕松將共聚焦激發(fā)體積調(diào)節(jié)接近至數(shù)學(xué)模型，從而得出更加準(zhǔn)確的FCS分析結(jié)果。其次，在做活體厚組織紅外多光子成像時(shí)，由于組織內(nèi)部的折射率不均一，會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)扭曲，熒光亮度大幅下降，通過motCORR對(duì)樣品折射率的校正，以獲得亮度和對(duì)比度更高的組織深部熒光圖像，達(dá)到更大的穿透深度。此外，motCORR可與高數(shù)值孔徑的水鏡、水鏡自動(dòng)加水微泵和AFC(adaptivefocus control)自適應(yīng)穩(wěn)焦系統(tǒng)全面兼容，輕松實(shí)現(xiàn)完美活細(xì)胞成像。

與50位技術(shù)專家面對(duì)面20年技術(shù)見證，附贈(zèng)技術(shù)全景圖

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的调焦后焦实现不同距离成像_“物镜校正环调节”对显微成像的影响的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。