本篇文章，我們將對(duì)應(yīng)用較廣的雙淬滅探針（Double-Quenched Probe）做詳細(xì)的介紹。

基于qPCR測(cè)試的結(jié)果，我們已將TaqMan??探針替換成為IDT PrimeTime?? 雙淬滅探針。ZEN??型雙淬滅探針?lè)浅＿m合我們甲基化生物標(biāo)志物的相關(guān)研究工作。靠近5'熒光基團(tuán)的淬滅劑ZEN??，不僅可以使qPCR探針在長(zhǎng)達(dá)40堿基的情況下依舊保持較好淬滅效果，而且顯著增加了探針的Tm值，非常適合癌癥相關(guān)研究。 – 安朵涅特·佩里 博士 高級(jí)研究員 愛(ài)爾蘭都柏林三一學(xué)院分子藥物研究所

“雙淬滅”探針顧名思義，就是有兩道“消防線”來(lái)保證熒光基團(tuán)的淬滅：在普通的5'核酸酶水解探針（圖1. A）的基礎(chǔ)上，除了探針3'端的普通淬滅基團(tuán)（例如，Black Hole Quencher等），另在探針中間額外添加淬滅基團(tuán)。

以IDT生產(chǎn)的經(jīng)典雙淬滅探針為例（圖1. B）：在探針第9、10堿基之間添加專利的ZEN??或TAO??淬滅劑，與3'端IDT改進(jìn)的專利淬滅基團(tuán)—Iowa Black?? Dark Quencher（IBRQ或IBFQ），構(gòu)成兩道“消防線”。

圖1. 普通5'核酸酶水解探針和雙淬滅探針的結(jié)構(gòu)（D：Dye，熒光染料；Q：Quencher，淬滅基團(tuán)；Z：ZEN??）

除了對(duì)熒光的淬滅作用，ZEN??還可以增強(qiáng)雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，阻止核酸外切酶的酶切作用，且無(wú)細(xì)胞毒性。這些特性使其被IDT廣泛應(yīng)用于anti-miRNA序列（anti-miRNA oligonucleotides），splice-switching序列（splice-switching oligonucleotides）和miRNA、mRNA及InRNA的原位雜交探針。

IDT目前有ZEN??型和TAO??型兩種雙淬滅PrimeTime?? qPCR探針（圖2），分別搭配不同的熒光基團(tuán)，兩道“消防線”，滅“火”于無(wú)形之中。

圖2. IDT雙淬滅qPCR探針結(jié)構(gòu)

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

更低的背景

正如文章開篇佩里博士所陳述，雙淬滅系統(tǒng)最重要的優(yōu)勢(shì)是能夠降低熒光背景噪音，實(shí)現(xiàn)高信噪比，從而減少qPCR實(shí)驗(yàn)中由高背景導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

如圖3所示，使用ZEN?型雙淬滅探針（藍(lán)色）qPCR的背景熒光值僅為單淬滅探針（綠色）的1/4。

圖3. 與普通單淬滅5'核酸水解探針相比，ZEN??型雙淬滅探針淬滅效果更強(qiáng)，背景信號(hào)更低。

一般來(lái)講，熒光染料和淬滅劑的距離變長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)更多的熒光“泄漏”。這時(shí)候，兩道“消防線”的雙淬滅探針便脫穎而出。如圖4所示，qPCR探針長(zhǎng)度在20或40個(gè)堿基，雙淬滅探針均可將背景熒光維持在較低的水平。

正如篇首所示，佩里博士在甲基化相關(guān)研究中，為了使探針的Tm值比引物高10°C 以上，設(shè)計(jì)了很多40堿基左右的雙淬滅探針，測(cè)試后對(duì)其表現(xiàn)大為贊賞。

圖4. 單/雙淬滅探針對(duì)不同長(zhǎng)度序列的淬滅效果

更為突出的是，雙淬滅探針在定量甲基化特異擴(kuò)增檢測(cè)（Quantitative Methylation-specific PCR, qMSP）中優(yōu)勢(shì)盡顯。未甲基化的CpG位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)亞硫酸鈉處理后，會(huì)變成AT-rich區(qū)域，在較廣長(zhǎng)度范圍內(nèi)均可正常“施展”的雙淬滅探針，可以較多的結(jié)合CpG位點(diǎn)，高效幫助研究人員探究甲基化的奧秘[1]。

更高的靈敏度

ZEN??型雙淬滅探針與單淬滅探針相比，qPCR實(shí)驗(yàn)Cq值降低，靈敏度升高。IDT在7900HT Real-Time PCR 系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件下，對(duì)比5種qPCR探針在不同的cDNA起始量（0.005 ng - 5 ng）β-Actin的Cq值。結(jié)果顯示，ZEN??型雙淬滅探針在不同的起始量下，平均Cq值均維持在最低的水平[2]。

圖5. 與單淬滅探針相比，雙淬滅探針在不同起始量下平均Cq值更低

2016年1月，瑞典烏普薩拉大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床病毒學(xué)的Hongyan Xia等人發(fā)表了利用巢式實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)諾如病毒（Norovirus）基因組II（Genogroup II，GII）的研究論文[3]。在針對(duì)諾如病毒的高度變異序列研究中，使用了長(zhǎng)引物和長(zhǎng)qPCR探針（多達(dá)56堿基）對(duì)GII進(jìn)行檢測(cè)。

研究人員測(cè)試了4種探針：LGC生產(chǎn)的內(nèi)部不同位置加BHQ1的探針（如圖6. A & B）和IDT生產(chǎn)的內(nèi)部加ZEN??的探針（單ZEN??雙淬滅探針和雙ZEN??三淬滅探針，如圖6. C & D）。

圖6. LGC和IDT生產(chǎn)的4種檢測(cè)諾如病毒的qPCR探針結(jié)構(gòu)

測(cè)試結(jié)果表明，LGC生產(chǎn)的NoProbe 1和NoProbe 2的檢測(cè)下限分別為1000 copies / reaction和100 copies / reaction，而IDT的ZEN??型探針NoProbe 3和NoProbe 4的檢測(cè)下限低至10 copies / reaction，甚至6孔中的3個(gè)達(dá)到1 copy / reaction。

圖7. 對(duì)諾如病毒GII通過(guò)qPCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.?(A) Noprobe 1. (B) Noprobe 2. (C) Noprobe 3. (D) Noprobe 4.

IDT 雙淬滅探針具有高靈敏度，不僅適用于高拷貝數(shù)的臨床樣本，也可用于環(huán)境和食品檢測(cè)或低拷貝數(shù)的病毒檢測(cè)[3]。

2017年德克薩斯大學(xué)藥學(xué)院Xiujuan Peng等人發(fā)表在Journal of Virological Methods的文章中，使用IDT雙淬滅探針和SYBR Green的qPCR方法均可對(duì)M13和T7噬菌體進(jìn)行檢測(cè)。與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）相比，qPCR方法可提高檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性。正是使用了ZEN??型雙淬滅探針，使得M13和T7噬菌體的檢測(cè)范圍低至27.5 copies/μL和 26.6 copies/μL[4]。

降低多重qPCR通道間串?dāng)_

雙淬滅探針有效降低背景信號(hào)的特性，還可以幫助實(shí)現(xiàn)多重qPCR（Multiplex qPCR），有效減少不同通道之間的串?dāng)_[4]。下面我們將通過(guò)一個(gè)IDT雙淬滅探針應(yīng)用于多重檢測(cè)的實(shí)例來(lái)了解兩道“消防線”帶來(lái)的“品質(zhì)保證”。

來(lái)自美國(guó)Tetracore公司的研發(fā)人員一直致力于研發(fā)基于qPCR的傳染病等診斷試劑，其檢測(cè)產(chǎn)品因適配多種PCR平臺(tái)，且在各種環(huán)境條件下表現(xiàn)穩(wěn)定，為軍隊(duì)、動(dòng)物檢疫等機(jī)構(gòu)提供了解決方案。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRSSV）可引起豬群多系統(tǒng)病癥。PRSSV主要包含美洲型（American-like）和歐洲型（European-like）兩種大類，對(duì)PRSSV進(jìn)行分類需要檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)。Tetracore公司開發(fā)的檢測(cè)方案，包含34條引物和8條qPCR探針，可以同時(shí)進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)。其中8條qPCR探針利用了3種熒光基團(tuán)，可以在3通道的qPCR平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，1個(gè)通道檢測(cè)對(duì)照組，其余7條探針?lè)謩e用其他兩個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)（表1）。

表1. PRSSV檢測(cè)探針熒光基團(tuán)與對(duì)應(yīng)通道

多重通道檢測(cè)熒光信號(hào)的串?dāng)_是個(gè)令人煩惱的問(wèn)題。為了使PRSSV多重檢測(cè)分辨率提高，研發(fā)人員引入了ZEN??型雙淬滅探針，即5'FAM/ZEN/3'IBFQ探針，與普通的單淬滅探針相比，可有效降低假陽(yáng)性，減少背景熒光。如圖8所示，利用18堿基的5'FAM修飾的qPCR探針對(duì)長(zhǎng)度為120 bp PRRSV區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，其中B11和B12（紅色）代表5'FAM/3'BHQ單淬滅探針，A7和A9（藍(lán)色）代表5'FAM/ZEN/3'IBFQ雙淬滅探針[5]。ZEN??使FAM熒光在測(cè)試的過(guò)程中不再干擾相鄰的Cy3通道。

圖8. ZEN??型雙淬滅探針解決了多重qPCR中的熒光“泄露”問(wèn)題

性價(jià)比高

目前IDT提供ZEN??型和TAO??型兩種雙淬滅PrimeTime?? qPCR探針，其搭配的熒光基團(tuán)如表2。

表2. IDT提供雙淬滅探針詳情

有任何技術(shù)問(wèn)題，歡迎搜索“北京澤平科技”進(jìn)行技術(shù)支持咨詢報(bào)價(jià)。

參考文獻(xiàn)

[1]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/epigenetic-biomarkers-for-prostate-cancer

[2]http://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/zen

[3]Xia, H., S. Gravelsina, C. Ohrmalm, J. Ottoson and J. Blomberg (2016). "Development of single-tube nested real-time PCR assays with long internally quenched probes for detection of norovirus genogroup II." Biotechniques 60(1): 28-34.

[4]Peng, X., A. Nguyen and D. Ghosh (2018). "Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR." J Virol Methods 252: 100-107.

[5]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/optimizing-multiplex-qpcr-for-detecting-infectious-diseases-and-biothreat-agents-in-the-field

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的【评测】TaqMan️探针和IDT PrimeTime️ 双淬灭探针的对比的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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