(western blot)

印跡技術

一般是你先實驗進行了一個電泳，然后把電泳后的產物（如DNA、蛋白質）通過印跡技術轉移到一個膜上，然后使用特異性的能識別此產物的探針或者抗體來識別，從而檢測產物。廣泛應用于DNA、RNA、蛋白和抗原等。

Western Blot 實驗

今天記錄一下western blot的實驗操作步驟及注意事項。

背景理論

將待檢測蛋白質（或酶）經SDS-PAGE電泳后，轉移到固相載體上，再用“抗體-抗原”免疫反應 或 “DNA-蛋白質”結合反應，鑒別膜上的蛋白質。用于蛋白質定性定量與相互作用研究，分析基因的表達程度。

檢測方法：①放射自顯影 ②偶聯反應+顯色（光化學）反應

實驗過程

SDS-PAGE——轉膜——封閉——檢測。

SDS-PAGE

1、來到Lab，首先把實驗用跑膠玻璃板洗干凈烘干。

2、配電泳液，一般向內槽中加入250ml即可。
緩沖液250ml：225ml ddH₂O + 25ml 10xTris甘氨酸電泳液
將膠板固定好。

3、配膠
一塊1.0厚玻板，一般需要分離膠5ml，濃縮膠2ml。

分離膠：選擇合適濃度，按照比例加入各組分。
1ml=1000μl

ddH₂O
30%丙烯酰胺（30%Acr/Bis制膠液）
1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10%SDS
10%APS
TEMED（即PAGE膠促凝劑） 最后加入

防止向玻板間加膠時膠已凝固，所以配的分離膠要不斷輕輕搖晃，并在1-2min內把膠加好

向玻板間加入分離膠5ml，加時盡量避免氣泡。再向分離膠間加入1-2ml ddH₂O，將分離膠壓平穩。加水時注意輕輕緩慢加入。分離膠干后，倒出ddH₂O，用吸水紙將殘留的水吸干凈。下一步加濃縮膠。

濃縮膠：按比例加入各組分
ddH₂O
30%丙烯酰胺（30%Acr/Bis制膠液）
1.0M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS
10%APS
TEMED（即PAGE膠促凝劑） 最后加入
配好濃縮膠后輕混勻，即刻加入到膠板的分離膠上面，加入2ml，插入梳子，等待其凝固。

濃縮膠凝固后，清洗干凈玻板表面，豎直拔下梳子。

短玻板向內側，推嚴實夾緊玻璃板，固定好膠架，正極對正極，負極對負極，放入電泳槽內。

向電泳槽內加入電泳液，加入量要溢出加滿，上面盡量無氣泡。

一般加Marker 10μl，加樣品 20μl。
蓋上電極蓋子。起始設置電壓80v，待樣品跑完濃縮膠，進入分離膠后，電壓調整為120v。（140v、160v可根據試驗需求，適當調整）

轉膜

待樣品跑完整塊凝膠后，停止電泳，將內槽液體丟棄（防止蛋白有溢出，再次用可能會交叉污染）。

將凝膠取下，切去濃縮膠，剩余分離膠部分，泡入轉膜工作液中，
濾紙—泡入轉膜工作液，PVDF膜，先用甲醇（乙醇）活化30s，再放入轉膜工作液中。

放置順序
負極
———— 濾紙
———— 凝膠
———— PVDF膜
———— 濾紙
正極

凝膠上的蛋白帶負電，向正極方向轉移，從而轉移到PVDF膜上

轉膜緩沖液（10x）1L ： Tris 30.3g + 甘氨酸144g + 不調pH值
轉膜工作液（1x） 1L ：10x轉膜緩沖液100ml + 甲醇（無水乙醇）200ml + ddH₂O 補齊到1L。

向槽內加入轉膜工作液。將印跡槽放入到泡沫箱中，蓋上電極蓋子。周圍加冰水混合物覆蓋降溫，防止產熱過多。

轉膜恒流。可設置300mA，60min，轉膜電流與時間的設置可調整。轉膜開始。

從封閉起的所有步驟，PVDF膜一定要保濕，不要使其離開液體環境太久，否則極易產生很高的背景，加液換液要迅速

封閉

取出轉膜完成的PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉15-30min。

倒掉脫脂奶粉，加入一抗，振搖1h，吸出一抗。

PBST振搖漂洗3次，每次10min，吸出漂洗液。

加入二抗，振搖速度以液面輕晃為宜，孵育50-60min，吸出二抗。

PBST振搖漂洗3次，每次10min，吸出漂洗液。

PBST：PBS + 吐溫20，吐溫20的終濃度為0.05%（體積比）。即2L PBST配制：需要 2000ml X 0.05% = 1ml 吐溫20。

檢測

將PVDF膜取出，豎直用吸水紙吸吸水分，放置在成像板上，滴加ECL化學發光劑于膜上（全覆蓋均勻）。選擇程序20幀30s，化學發光，曝光，成像，讀取結果。

5%脫脂奶粉：2.5g脫脂奶粉→50ml PBST中

一抗：按說明書稀釋，一般一抗稀釋1000倍，用PBS稀釋（可反復使用多次），或用脫脂奶粉稀釋（反復用不久）。

二抗：按說明書稀釋，一般稀釋4000-5000倍，用PBST稀釋。

ECL化學發光試劑：白瓶+黑瓶，現用現配，1:1比例配用。
一般一張膜 250μl 即夠用。
配制方法：白瓶 250μl + 黑瓶 250μl，混勻，直接取 250μl 滴加到成像板上的PVDF膜上。

附上分離膠/濃縮膠常用配制濃度及體積

總結

以上是生活随笔為你收集整理的Western blot 技术的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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