商 瑜，張啟明，李 悅，王瑩冰 （北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 １００８７５）

摘 要：

隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷 擴(kuò)大和提高，無血清培養(yǎng)基的研制和開發(fā)已經(jīng)成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。無血清培養(yǎng)基的發(fā) 展歷經(jīng)了無血清來源、無動(dòng)物源、無蛋白和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等四個(gè)階段，逐步使得無血清培養(yǎng) 基的成分更為明確和簡(jiǎn)單，進(jìn)一步提升了無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中可避免外源物污染等的優(yōu)勢(shì)， 使其在生物制品和生命科學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。本文主要系統(tǒng)總結(jié)了無血清培養(yǎng)基的 發(fā)展歷程、組分構(gòu)成和優(yōu)化方法，尤其對(duì)無血清培養(yǎng)基近年來在生物制品、干細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤研究 等方面的最新開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了扼要分析述論，以期對(duì)無血清培養(yǎng)基在生物學(xué)前沿領(lǐng)域的應(yīng)用和優(yōu) 化提供可借鑒的方向，尤其在腫瘤干細(xì)胞的方面可以進(jìn)行更深入的探索。

關(guān)鍵詞：無血清培養(yǎng)基；生物制品；細(xì)胞培養(yǎng) 中圖分類號(hào)：Ｑ８１ 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ

　動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)近年來發(fā)展迅速，已經(jīng)成為 生物工程領(lǐng)域中的前沿研究課題之一。其在生物制 品的生產(chǎn)、腫瘤細(xì)胞的體外建模、病毒的分離鑒定和 機(jī)體發(fā)育功能研究等方面均有重要應(yīng)用。通常，為 了提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的激素、生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，動(dòng)物 細(xì)胞是在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的。但血清成 分復(fù)雜且不完全明確，批次間容易產(chǎn)生較大差異，培 養(yǎng)中易發(fā)生外源物污染，并且血清本身價(jià)格也比較昂貴等；這些均使得血清在生產(chǎn)和研究中的應(yīng)用存 在諸多不利。目前，已有大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)無血清 培養(yǎng)基不僅能避免或改善含血清培養(yǎng)基所帶來的上 述缺陷，也能獲得良好的培養(yǎng)效果并維持原有生物 學(xué)功能［１］。歐洲替代方法研究中心科學(xué)咨詢委員會(huì) （Ｔｈｅ ＥＣＶＡＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ， ＥＳＡＣ）和歐 洲 體 外 毒 理 學(xué) 會(huì)（ＥｕｒｏｐｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆ ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＩｎｖｉｔｒｏ，ＥＳＴＦＶ）等多個(gè)機(jī)構(gòu)組織均發(fā) 表聲明，強(qiáng)烈建議減少細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中血清等 動(dòng)物源性物質(zhì)的添加，盡可能在現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域 使用無血清培養(yǎng)基［２］。由此可見，無血清細(xì) 胞 培 養(yǎng) 技術(shù)的研究日益受到人們的關(guān)注，并逐漸成為當(dāng)今 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域的主流與趨勢(shì)。

無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程 無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起 來的，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，既能滿足細(xì)胞在體外長(zhǎng) 時(shí)間培養(yǎng)的要求，又能避免動(dòng)物血清所帶來的不利 因素。無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程一般分為無血清培 養(yǎng)基、無動(dòng)物源培養(yǎng)其、無蛋白培養(yǎng)基及化學(xué)成分限 定培養(yǎng)基等四類［３］。

１．１ 無血清培養(yǎng)基（Ｓｅｒｕｍ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＳＦＭ）

無血清培養(yǎng)基，即為不添加動(dòng)物血清。但 是 為 了滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)，會(huì)添加替代血清功能的生物材 料，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和動(dòng)植物的提取物等。這使 得此類培養(yǎng)基中含大量動(dòng)植物來源蛋白，添加物質(zhì) 的化學(xué)成分也不夠明確［４］。因此，會(huì)對(duì)后續(xù) 處 理 應(yīng) 用造成部分不利影響（如目標(biāo)蛋白的分離純化），同 時(shí)成本也較高。由于人們可以就實(shí)際需求對(duì)其進(jìn)行 相對(duì)簡(jiǎn)單的成分改進(jìn)，使得其應(yīng)用仍較為廣泛。

１．２ 無動(dòng)物源培養(yǎng)基（ＡｎｉｍａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＦｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＡＣＦＭ） 此類培養(yǎng)基采用蛋白水解物、重組蛋白或其他 化學(xué)物質(zhì)來取代動(dòng)物源蛋白。它既可以滿足細(xì)胞生 長(zhǎng)及增殖的需要，還能夠降低培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本，提 高重組蛋白類藥物安全性［５］。目前主要應(yīng)用于生物 藥品的研發(fā)和生產(chǎn)中。

１．３ 無蛋白培養(yǎng)基（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＰＦＭ） 該 類 培 養(yǎng) 基 完 全 不 含 有 血 清 和 動(dòng) 物 來 源 的 蛋 白，但仍包含來源于植物蛋白的水解物或合成多肽 片段等其他衍生物。由于所含蛋白極低，并且蛋白 成分明確，有 利 于 重 組 蛋 白 的 下 游 生 產(chǎn)、分 離 和 純 化，總體成本也會(huì)大幅 下 降［６－７］。但 其 通 用 性 較 差， 需要針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞株進(jìn)行特異性的優(yōu)化［８］。目前主 要應(yīng) 用 于 生 命 科 學(xué) 研 究 和 基 因 工 程 藥 物 開 發(fā) 等 領(lǐng)域。

１．４ 化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＤｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ，ＣＤＭ） 此類培養(yǎng) 基 完 全 無 血 清、無 蛋 白，成 分 完 全 明 確，可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性。它既有利于 跟蹤細(xì)胞培養(yǎng)的代謝情況，在后續(xù)的分離純化中也 非常方便，是目前最為安全和理想的培養(yǎng)基。可是 并非所有的細(xì)胞都能在化學(xué)限定培養(yǎng)基中達(dá)到較高 的表達(dá)水平，需要不斷改進(jìn)設(shè)計(jì)方案和配方［９］。 ２ 無血清培養(yǎng)基的組分構(gòu)成和 設(shè)計(jì)優(yōu)化

２．１ 無血清培養(yǎng)基的組分構(gòu)成 無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的 補(bǔ)充因子兩部分組成。基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常是按一定比 例的葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽和維生素等組合而成的 合成培養(yǎng)基，它是維持組織或細(xì)胞生長(zhǎng)代謝必不可 少的物質(zhì)。而補(bǔ)充因子，替代了傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的血 清，既能有效避免血清帶來的諸多問題，也能滿足動(dòng) 物細(xì)胞培養(yǎng)的要求。補(bǔ)充因子根據(jù)需求的必要性一 般分為必需補(bǔ)充因子和特殊補(bǔ)充因子。必需補(bǔ)充因 子是所有細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)都需要 的，包括胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白等。特殊補(bǔ)充因子一般 含有激素、生長(zhǎng)因子微量元素、貼壁和鋪展因子、維 生素和酶抑制劑等。

２．２ 無血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)優(yōu)化 在無血清培養(yǎng)基的具體應(yīng)用中，可以通過選擇 或優(yōu)化適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子的種類及用 量，使其更符合培養(yǎng)要求。例如，細(xì)胞工程的常用細(xì) 胞 ＣＨＯ 往 往 是 利 用 ＤＭＥＭ ∶Ｆ１２∶ＲＰＭＩ１６４０ （２∶１∶１）［１０］或者 ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２［１１］作為基礎(chǔ)培 養(yǎng) 基，而 Ｖｅｒｏ 的 常 用 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 則 為 Ｍ１９９、 ＤＭＥＭ 或Ｆ１２等。對(duì)于補(bǔ)充因子，更是不斷嘗試優(yōu) 化開發(fā)新的替代品。如必需補(bǔ)充因子中的胰島素， 因其費(fèi)用昂貴，目前有研究報(bào)道可利用金精三羧酸 （ＡｕｒｉｎＴｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ，ＡＴＡ）作為胰島素替代 物培養(yǎng) ＣＨＯ 細(xì)胞，細(xì)胞的生長(zhǎng)正常，并極大降低了 成本［１１］。轉(zhuǎn)鐵蛋白是細(xì)胞無血清培養(yǎng)最重要的補(bǔ) 充因子之一，它的缺失會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)它也 是一些有害微量 元 素 的 螯 合 劑。Ｒｏｕｒｏｕ等 在 研 究 Ｖｅｒｏ細(xì)胞無血清培養(yǎng)基時(shí)認(rèn)為，維生素 Ｃ和檸檬酸 鐵混合使用可以替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，這為尋求轉(zhuǎn)鐵蛋白 替代品提供了參考［１２］。

通常，為了更好地達(dá)到無血清培養(yǎng)基組分優(yōu)化 開發(fā)，研究人員可采用培養(yǎng)過程分析法、分子生物技 術(shù)法和統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)法等方法進(jìn)行系統(tǒng)分析，進(jìn)而獲 得滿足目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)要求的無血清培養(yǎng)基［１３］。

２．２．１ 培養(yǎng)過程分析法 培養(yǎng)過程分析法是以動(dòng) 態(tài)的細(xì)胞代謝為基礎(chǔ)，通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中各培 養(yǎng)基的組分進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，了解細(xì)胞的生理狀態(tài)變 化，根據(jù)需求調(diào)整培養(yǎng)基組分及補(bǔ)料策略的設(shè)計(jì)方 法。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各培養(yǎng)組分必須維持在一 定水平。因此可以通過消耗組分分析法來對(duì)葡萄 糖、谷氨酰胺、維生素和氨基酸等組分進(jìn)行設(shè)計(jì)；也 可以通過化學(xué)計(jì)量分析法，建立培養(yǎng)基各組分與細(xì) 胞能量代謝、生物量或蛋白合成量之間的化學(xué)計(jì)量 函數(shù)，從而對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略進(jìn) 行設(shè)計(jì)。

２．２．２ 分子生物技術(shù)法 分子生物技術(shù)法是以基 因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)為依托的一種高通量的設(shè)計(jì) 方法。研究人員可以應(yīng)用基因芯片、抗體芯片和雙 向凝膠電泳等技術(shù)，在 ｍＲＮＡ 和蛋白水平上獲得細(xì) 胞培養(yǎng)過程中關(guān)鍵基因或蛋白的變化情況，用以確 定培養(yǎng)基中調(diào)控這些基因或蛋白表達(dá)的成分的添加 類型和比例，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等生 理指標(biāo)［１４］。

２．２．３ 統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法 統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是 通過在培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)、優(yōu)化及數(shù)據(jù)結(jié)果分析中運(yùn)用 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，經(jīng)濟(jì)地獲得可靠結(jié)果，并將誤差降到最 低的一種設(shè)計(jì)方法。由于其省時(shí)省力，具有快速獲 得大量參數(shù)的優(yōu)勢(shì)，近年來被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng) 及過程優(yōu)化中，并取得了卓有成效的研究成果。如 ２０１０年Ｊｅｏｎ等人利用分式析因設(shè)計(jì)和響應(yīng)面的統(tǒng) 計(jì)學(xué)方法對(duì)人 細(xì) 胞 毒 素 Ｔ 淋 巴 細(xì) 胞 無 血 清 培 養(yǎng) 基 中的卵磷脂、多 胺、抗氧化劑和膽固醇進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu) 化，最終獲得最高活細(xì)胞密度比有血清培養(yǎng)基高１．５ 倍的無血清培養(yǎng)基，而且其 Ｔ 淋巴細(xì)胞效應(yīng)功能仍 然保留［１５］。

無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用

３．１ 生物制品和生物藥物研制與生產(chǎn)方面的應(yīng)用 目前，生產(chǎn)生物活性蛋白、疫苗、單克隆 抗 體 和 基因治療藥物的表達(dá)載體等生物制品時(shí)一般都采用 可高密度生長(zhǎng)的動(dòng)物工程細(xì)胞。無血清培養(yǎng)技術(shù)的 運(yùn)用，給動(dòng)物工程細(xì)胞提供了更優(yōu)的生長(zhǎng)條件，進(jìn)而 表達(dá)更多的目的產(chǎn)物，并有利于后續(xù)目的產(chǎn)物的分 離和純化，顯 示 了 其 強(qiáng) 大 的 優(yōu) 勢(shì)。Ｋｕｔｓｕｚａｗａ等 在 研究新的３Ｄ 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 時(shí) 發(fā) 現(xiàn)，無 血 清 培 養(yǎng) 基 較 有 血清培養(yǎng)基可提高大約３倍的重組蛋白產(chǎn)量，使該 系統(tǒng)能更好 地 適 用 于 生 物 制 藥 生 產(chǎn)［１６］。為 避 免 生 物制品的血清污染，Ｔｏｒｉｎｉｗａ等研究得到一種用無 血清培 養(yǎng) 基 生 產(chǎn) Ｖｅｒｏ細(xì) 胞 源 乙 型 腦 炎 疫 苗 的 方 法，而且其疫苗可通過添加穩(wěn)定劑（如山梨醇或甘氨 酸），實(shí)現(xiàn)在室溫下儲(chǔ)存［１７］。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ 等 利 用 ＣＨＯ 細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)，在無血清條件下 培養(yǎng)，就無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基適應(yīng)性進(jìn)行了 對(duì)比評(píng)價(jià)，指出相比于 ＤＥＭＥ培養(yǎng)基，ＥＸ－ＣＥＬＬ培 養(yǎng)基更有利于單克隆抗體的生產(chǎn)，這為后續(xù)單抗的 研發(fā)生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)［１８］。Ｋｕｒｏｄａ等在研發(fā) 慢病毒載體 生 產(chǎn) 方 法 時(shí)，開 發(fā) 了 培 養(yǎng) 人 胚 腎 ＨＥＫ ２９３細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，從而獲得了低成本、無批 次差異且高滴度的慢病毒載體［１９］。所以說，無血清 培養(yǎng)基清晰明確的成分以及完善的質(zhì)控體系，使得 制備生物制品和生物藥物的宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)過程 中更加穩(wěn)定，產(chǎn)物表達(dá)效率更高，產(chǎn)品質(zhì)量更加安全 可靠。

３．２ 干細(xì)胞培養(yǎng)和研究方面的應(yīng)用 干細(xì)胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＳＣ）是一類具有自我復(fù)制 能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多 種功能細(xì)胞，因此對(duì)其培養(yǎng)條件的質(zhì)量控制成為關(guān) 鍵。目前，鑒于無血清培養(yǎng)基擁有明確成分的特性， 它已被 廣 泛 應(yīng) 用 于 干 細(xì) 胞 的 體 外 培 養(yǎng) 和 研 究 中。 Ｓｗａｍｙｎａｔｈａｎ等通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 ＭｅｓｅｎｃｕｌｔＴＭ間 充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基相較有血清培養(yǎng)基，完全 可以為臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞提供體外大規(guī)模培 養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)條件；無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞保 留了臨床治療所需要的干細(xì)胞特性，并且減少了因 血清帶來的后續(xù)治療中的潛在危險(xiǎn)［１］。另 一 方 面， 研究人員不斷開發(fā)新型無血清培養(yǎng)基，以提高培養(yǎng) 效率或者適用于不同誘導(dǎo)分化需求。Ｚｈａｎｇ等利用 含 有 ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＧＦ－１、ｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ５ 和 ＩＧＦＢＰ２等五種因子的無血清培養(yǎng)基可以使人臍血 造血干細(xì)胞（ＨＳＣ）在 體 外 生 長(zhǎng) 速 度 提 高２０倍，為 臨床應(yīng)用提供培養(yǎng)條件上的支持［２０］。Ｐｉｃｋ等 則 開 發(fā)了一個(gè)無血清無滋養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)，他們利用該系統(tǒng) 成功從人胚胎干細(xì)胞分化獲得可產(chǎn)生血小板樣細(xì)胞 的骨髓巨核細(xì)胞，這使得人類朝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲 得治療用人 類 血 小 板 又 邁 進(jìn) 了 一 大 步［２１］。最 近 研 究報(bào)道，為了應(yīng)對(duì)腸道組織天然干細(xì)胞來源不足的 問題，Ｍａｈｍｏｕｄ等開發(fā)出一種適宜腸道干細(xì)胞體 外增殖的無血清培養(yǎng)基，他們添加了乙醇胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗壞血酸磷酸鹽、亞硒酸鈉和谷胱甘肽等五種補(bǔ) 充因子［２２］。該成 果 對(duì) 于 基 礎(chǔ) 研 究 和 臨 床 應(yīng) 用 均 具 有積極意義。

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總結(jié)

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