與PCR、qPCR等技術(shù)一樣，作為分子實(shí)驗(yàn)室必備手段，分子克隆技術(shù)被廣泛用于多樣的基因功能研究。所謂分子克隆指的是在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增殖能力和表達(dá)。

基因克隆技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷3個(gè)階段，第一階段為經(jīng)典的T4 DNA連接酶介導(dǎo)的TA克隆及粘性末端克隆，第二階段為基于DNA修飾酶的LIC系列克隆，第三階段為基于DNA重組酶的Gateway克隆及一步法克隆。

一、基于T4 DNA連接酶的克隆

本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA連接酶。

限制性內(nèi)切酶：可以對(duì)目的片段和載體識(shí)別并切割出相同的粘性末端，用于堿基互補(bǔ)配對(duì)。

T4 DNA連接酶：可以催化目的片段和載體最后一位堿基上的5’磷酸基團(tuán)和3’羥基形成磷酸二酯鍵，以實(shí)現(xiàn)將目的片段和載體連接成環(huán)狀質(zhì)粒。

根據(jù)是否使用限制性內(nèi)切酶，可分為平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。

二、基于DNA修飾酶的克隆方法

本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP時(shí)，表現(xiàn)為3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和載體，產(chǎn)生單鏈的DNA粘性末端；加入某一單獨(dú)dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，摻入與切割動(dòng)態(tài)平衡，切割終止。因此，T4 DNA聚合酶為基礎(chǔ)的克隆方法的關(guān)鍵是目的基因和載體間需要有一定數(shù)量的重疊序列。

三、基于重組酶的克隆方法

Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶類為：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大腸桿菌IHF因子。

該技術(shù)需要四個(gè)特異性重組位點(diǎn)（attB、aatP、attL、attR），引導(dǎo)發(fā)生兩個(gè)特異性重組反應(yīng)（BP反應(yīng)和LR反應(yīng)）。BP反應(yīng)：將目的基因克隆進(jìn)入入門質(zhì)粒。使用到的酶為Int和IHF。LR反應(yīng)：將入門質(zhì)粒中的目的基因轉(zhuǎn)移到終載體中，獲得表達(dá)載體。使用到的酶為Int、IHF及Xis。表達(dá)載體若帶有attR位點(diǎn)，則帶有attL位點(diǎn)的入門克隆便可以與之發(fā)生LR反應(yīng)，進(jìn)而將入門克隆的目的基因轉(zhuǎn)移到不同類型的表達(dá)載體中。

通過以上方法克隆的基因只有通過表達(dá)才能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)上、以至在工業(yè)上都是很有應(yīng)用價(jià)值的，可以克隆其基因使之在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)而獲得。而要使克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，就要將它放入帶有基因表達(dá)所需要的各種元件的載體中，形成表達(dá)克隆。此過程繁雜且周期長(zhǎng)，GeneCopoeia可提供豐富多元的OmicsLinkTM即用型ORF表達(dá)克隆。這種即用型即用型表達(dá)克隆是將研究基因的ORF裝在帶有不同蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體中，可直接用于體內(nèi)或體外不同宿主或表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)和功能研究，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)人員耗費(fèi)在亞克隆步驟上的大量精力和時(shí)間。

目前GeneCopoeia可提供140,000個(gè)預(yù)制即用型Nextday-ORF?克隆。無需再等上數(shù)日/數(shù)周即可馬上進(jìn)行基因表達(dá)或蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。每一個(gè)Nextday-ORF?克隆均經(jīng)過序列驗(yàn)證，次日寄送，且多種病毒、非病毒類載體可選。

全方位科研需求的表達(dá)系統(tǒng)可供選擇

1.大腸桿菌表達(dá)克隆載體 ?(15 種)

2.哺乳細(xì)胞表達(dá)克隆載體? (48種)

3.慢病毒表達(dá)克隆載體 ?(82種)

4.酵母表達(dá)克隆載體 (3 種)

5.昆蟲細(xì)胞表達(dá)克隆載體 ?(1 種)

6.麥胚無細(xì)胞表達(dá)克隆載體? (8 種)

除了可以直接提供即用型表達(dá)克隆，GeneCopoeia也可提供構(gòu)建表達(dá)載體所用的酶以及中間載體——重組酶mix：EZRecombinase LR混合液，貨號(hào)：RCBM-1001-020

作為GeneCopoeia在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技將為中國(guó)客戶提供最全面的GeneCopoeia公司產(chǎn)品以及客戶訂制化服務(wù)。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的克隆需要验证_GeneCopoeia基因克隆的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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