猕猴桃的红色果肉受到特定的激活-抑制系统的控制
文章信息
題目：The red flesh of kiwifruit is differentially controlled by specific activation–repression systems
刊名：New Phytologist
作者：Wen-qiu Wang，Andrew C. Allan,Xue-ren Yin et al
單位：Zhejiang University
日期：29 March 2022?
01
摘要
花青素是授粉和種子傳播的視覺線索。含有花青素的水果也因其外觀和健康益處而吸引消費者。在獼猴桃（獼猴桃屬）中，研究已經確定了至少兩種花青素 MYB 激活劑，但它們在水果中的功能以及它們的作用機制尚不完全清楚。
在這里，轉錄組和小 RNA 高通量測序被用于全面鑒定獼猴桃中花青素積累的貢獻者。
在葡萄藤中穩定的過表達表明，35S::MYB10和MYB110都可以上調獼猴桃果實中花青素的生物合成，并且MYB10的過表達導致花青素積累僅限于內果皮，表明抑制機制是該物種花青素生物合成的基礎。此外，MYB10/110的 C 末端區域中的基序被證明與花青素反應的激活強度有關。瞬時分析表明MYB10和MYB110 均不被 miRNA 直接切割，但 miR828 及其定相小 RNA AcTAS4-D4(-) 有效靶向MYB110。鑒定了在內果皮和外果皮之間差異表達的其他miRNA，并觀察到SPL13、ARF16、SCL6和F-box1的切割，這些都是MYB10的阻遏物。
我們得出結論，是 MYB 激活劑的差異表達和隨后的抑制導致獼猴桃物種中花青素積累的變化。
02
技術路線
Hongyang’ (Actinidia chinensis) kiwifruit at colour change stage
Kiwifruit and Nicotiana benthamiana total RNA extraction
First-Strand cDNA synthesis and RT-qPCR (Real-Time Quantitative PCR)
High-throughput sequencing and analysis
Kiwifruit stable transformation
Genome synteny and collinearity Analysis
Isolation and cloning of candidate genes and MIRNAs
Transient over-expression in Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana plants
Dual-luciferase assays
Anthocyanin extraction and quantification
Firefly luciferase complementation imaging assay (LCI)
03
主要結果
3.1 紅陽獼猴桃花色素苷代謝關鍵基因的鑒定
授粉10周后，花青素在“紅陽”果實的內果皮中明顯積累（圖1a）。通過RNA高通量測序，以探索基于高質量參考基因組（Red5）的關鍵基因。根據先前的研究總結了編碼生物合成酶的花青素相關基因（圖1b，補充表S6）。進一步的分析表明，F3H1、F3H2、F3’5'H、F3GT1和GST1與發育系列和差異組織中花青素積累的視覺觀察結果呈正相關（圖1a，補充圖S1）。
我們根據共表達基因的表達模式（R≥0.6，圖1c），以及它們在獼猴桃基因組中的位置。從該分析中，我們發現279個基因與所有這五個花青素相關基因共表達（補充圖S2a，b；補充表S2）。這些基因在發育和空間上都受到調控，在內果皮中高度表達，表明受轉錄調控。
PlantTFDB（植物轉錄因子數據庫）用于分析279個基因，其中17個被預測為轉錄因子，包括NAC、AP2、MADS和MYB（補充圖S3a、b；補充表S2）。所有轉錄因子都被克隆，并在煙草葉中瞬時過表達。17種TF與花青素積累相關，但只有MYB10激活了煙草中的花青素水平。使用MYB110作為對照，其具有比MYB10更強的激活作用（補充圖S4）。然而，其他16種TF中沒有一種有助于MYB10活性（補充圖S5），事實上有三種是強阻遏物（Acc23145/HSFB3、Acc25983/C2H2-82和Acc29865/MYB223）。共表達分析的預測包括MYB10，實時定量PCR（RT-qPCR）證實了這一點，該PCR顯示MYB110的轉錄水平在整個果實發育過程中在內果皮中較高（圖1d）。因此，轉錄組和瞬時分析支持MYB10在“紅陽”水果著色中的重要性。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 1
3.2 獼猴桃中MYB10和MYB110的過度表達揭示了不同的功能
獼猴桃（品種A.chinensis cv.Hort16A）中35S:：MYB10和35S::MYB110的穩定過表達增加了葉片中的花青素含量。盡管在“紅陽”中未檢測到MYB110，但基于RNA seq或RT-qPCR（補充圖S6a，b），我們的結果表明，MYB10和MYB11在過度表達時，都會產生積累花青素的果實（圖2）。對照品系保留黃色果肉，類似于果園種植的“Hort16A”果實。
MYB10過表達植物的果實在內部果皮中積累花青素（圖2），盡管MYB110由組成型35S啟動子驅動。RT-qPCR用于比較外果皮和內果皮之間的轉錄水平，這表明轉基因在整個果實中表達良好，但在內果皮中表達稍高（補充圖S7）。因此，這些MYB10過度表達的水果現象復制了“紅陽”水果的自然外觀。相比之下，MYB110過表達系在果肉和皮膚的所有區域都積累了花青素（圖2），這反映出了黑木耳和黑木耳的紅色肉質選擇，其中MYB10已被觀察到表達。RT-qPCR顯示MYB110在外果皮和內果皮中組成性表達（補充圖S7）。因此，MYB10和MYB110似乎足以激活獼猴桃屬植物的花青素。MYB10和MYB110在果實中過度表達時的表型表明，潛在的阻遏物控制花青素合成和最終外觀。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 2
3.3 獼猴桃中MYB10和MYB110的進化分析揭示了激活花青素生物合成的關鍵基序
系統發育分析表明，MYB10和MYB110是同源基因，它們與另一個MYB（Acc10227）聚集成一個亞組（補充圖S8）。Acc10227（MYB210）已在獼猴桃雜交種群中鑒定，與MYB110緊密相關。這些結果暗示了一種潛在的遺傳關系。MCscanX用于檢測獼猴桃基因組中是否存在共線性。有趣的是，分析顯示，在一個分別含有MYB10和MYB110/210的區域，Chr01:6720929-9462208和Chr09:5346916-7131334顯示了大規模連鎖（圖3a）。微合成圖顯示MYB110和MYB210位于Chr09:5346916-7131334上，緊密連接但不直接連接。分析表明MYB10和MYB210是直接共線的。此外，MYB110和MYB210更可能是近端重復的產物。MYB10和MYB110在不同的獼猴桃中表達，它們在進化過程中趨向于亞功能化（導致不同的紅色果實表型）；MYB210在花瓣、肉或其他組織中未檢測到，因此可能沒有功能。
對MYB10和MYB110蛋白序列的比較顯示了C末端區域的差異（圖3b）。MYB10和MYB110都含有一個非常相似的R2R3結構域，以及一組C端殘基，分別稱為MYB11基序和MYB110基序（圖3b）。為了測試這些MYB10-或MYB110基序是否影響花青素誘導的效率，我們交換了基序或將其從編碼序列中刪除（圖3b）。瞬時分析表明，MYB110基序可以增加MYB10的花青素積累水平（MYB10C，圖3c，d），而攜帶MYB12基序的MYB11在花青素誘導方面表現出顯著損失（MYB110C，圖3c，d）。此外，當C端基序缺失（MYB110D和MYB10D）時，滲透導致花青素誘導很少（圖3c，d）。因此，MYB10/110的C末端的基序被顯示為影響花青素產生的強度。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig.3
3.4 “紅陽”果實抑制性轉錄過程的鑒定
盡管MYB10在整個果實中都有表達，但過表達MYB110的果實的色素沉著模式與“紅陽”果實表現出相似的外觀。這表明，由MYB10表達驅動的花青素積累進一步受到抑制機制的影響，這種抑制機制在外果皮中表現得更強。此外，MYB110在“紅陽”果實中不表達。因此，分析了MYB10和MYB110的潛在阻遏物。
進行小RNA測序以檢測“紅陽”果肉中表達的miRNA。發現了近2800個具有潛在前體的成熟miRNA。主成分分析（PCA）表明，內果皮和外果皮在PCA2維度上有區別（圖4a）。共表達分析顯示，授粉后10周和12周（WAP），當比較外果皮和內果皮中的miRNA水平時，15個miRNA上調，5個下調（圖4b，c；補充表S7）。然而，預測分析（使用psRobot軟件）表明，這些不同表達的miRNA不能直接切割MYB10或MYB110。發現MYB11和MYB12與AtMYB75（AtPAP1）和AtMYB90（PAP2）同源，已證明其受相iRNA AtTAS4-siR81（-）調控。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 4
在小RNA測序數據中發現了一種類似于AtTAS4-siR81（-）的小RNA，具有四個核苷酸差異（補充圖S10a）。該推測的小RNA被預測與MYB110（補充圖S10b）有效結合，但與MYB1 0無效。推測的小RNA位于Chr05:14577221-14577201上，然后延伸300 bp至側翼區域，其中發現了miR828靶位點（圖5a）。在該區域發現了大量的小RNA，這觀察到了階段RNA的生成規律（補充圖S11）。因此，我們將該區域視為AtTAS4的同源基因座，它包含位于D4（-）區域的假定小RNA，我們稱其為AcTAS4-D4（-）。檢測到五種潛在的miR828前體（稱為MIR828a-e），其中兩種類型的成熟miR826是由這些前體產生的。miRNA活性的雙熒光素酶分析支持這五種前體產生成熟的miRNA（miR858a至e），隨后切割AcTAS4（圖5b）。
將含有MIR828a、AcTAS4和MIR829a+AcTAS44的農桿菌滲透到本氏菌葉片中。RT-qPCR檢測葉片中phasiRNA的生成；當用空載體或MIR828a注射時，在煙葉中不能檢測到AcTAS4-D4（-）。然而，當MIR828a和AcTAS4的混合物被滲透時，AcTAS4-D4（-）的豐度顯著增加。單獨滲透的AcTAS4也會導致AcTAS4-D4（-）出現，這可能由內源性煙草miR828觸發（圖5c）。此外，miRNA雙熒光素酶分析進一步顯示AcTAS4-D4（-）可以有效切割MYB110（圖5d）。MYB10和MYB110是擬南芥亞群S6 MYB的同源物。在先前的研究中，AtMYB75（AtPAP1）、AtMYB 90（AtPAP2）和AtMYB113被預測受AtTAS4-siR81（-）調控。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 5
在獼猴桃中，MYB110被TAS4位點產生的phasiRNA切割，盡管與擬南芥有一些核苷酸差異（圖6a）。然而，分析表明MYB10將逃脫AcTAS4-D4（-）和AtTAS4-siR81（-）的切割（圖6a）。當與AcTAS4-D4（-）共滲透時，MYB110的花青素誘導活性顯著降低（圖6b；補充圖S12a），但對MYB10驅動的花青苷積累沒有影響（圖6a；補充圖S2b）。當MYB110中AcTAS4-D4（-）的靶位點突變時，在不改變氨基酸序列的情況下（補充圖S13），它不再受AcTAS4-D4（-1）的調控。過度表達結果表明，MYB110在獼猴桃中產生暗紅色愈傷組織，而MYB110m產生黑色愈傷組織（圖6c）。MYB110m愈傷組織中的花青素積累量是MYB110的三到六倍（圖6d和e），雖然呈黑色，但提取時呈深紅色。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 6
3.5 miRNA靶向介導的miRNA對MYB10的抑制
由于MYB10不受表達的miRNA或AcTAS4-D4（-）直接調控，我們研究了可能影響MYB12活性的其他抑制機制。研究了涉及miRNA的其他靶點的間接調控。根據我們的目標預測（通過psRobot軟件），每個miRNA通常針對一類特定的基因，其中許多是轉錄因子（補充表S3）。這些轉錄因子包括SQUAMOSA啟動子結合蛋白樣（SPL）、生長素應答因子（ARF）、SCL和APETALA2（AP2）。為每個miRNA選擇一個有代表性的靶基因，然后進行miRNA雙熒光素酶測定，以確定這些基因是否被相應的miRNA直接抑制。
實驗證實所有靶轉錄因子都被相應的差異表達miRNA（DEmiRNA；圖7a）切割。為了測試DEmiRNA對花青素積累的間接調節，在miRNA結合位點突變所有靶基因（氨基酸序列未改變），以防止由同源內源性煙草miRNA驅動的任何影響（補充圖S14）。
使用這些突變的TF構建體，進行顯色瞬時分析，以評估靶點對MYB10的抑制作用。顯色分析清楚地表明SPL13（Acc29651；或SQBP28）、ARF16（Acc08534）、SCL6（Acc15797；或GRAS76）和F-box1（Acc08265）可有效抑制MYB12（圖7b；補充圖S15）。其中，ARF16和F-box1的效果最為顯著，而SPL13和SCL6可以將花青素積累減少到40-50%（圖7b；補充圖S15）。這些結果表明，一組抑制性轉錄因子本身是miRNAs的靶標，可以介導MYB10蛋白活性的抑制，并可能在果實外果皮中起作用。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 7
3.6 miRNA靶向抑制MYB10是通過MBW轉錄復合物中MYB110的競爭實現的
從煙草中花青素積累的結果來看，一組miRNA靶點通過抑制MYB10蛋白影響花青素的積累。亞群6分支的MYB通過形成MYB-bHLH-WD40復合物控制花青素生物合成。因此，進行熒光素酶測定以測試miRNA靶點是否改變MBW復合物。熒光素酶的C端（CLUC）或-N端（NLUC）與靶蛋白或MBW復合物的成員融合。正如預期的那樣，SPL13（Acc29651）、ARF16（Acc08534）、SCL6（Acc15797）和F-box1（Acc08265）的過度表達顯著降低了MYB10和bHLH5的相互作用（獼猴桃bHLH4，Acc19563；圖8a）。四種最強的抑制因子中有三種是轉錄因子SPL13、ARF16和SCL6。
此外，螢火蟲熒光素酶互補分析支持SPL13，ARF16及SCL6可以結合MYB10蛋白形成蛋白-蛋白復合物（圖8b）。因此，似乎miRNA靶點SPL13、ARF16和SCL6可以通過與MBW復合物競爭MYB10來抑制花青素積累。F-box1（Acc08265）蛋白被注釋為屬于E3泛素連接酶家族的蛋白質，其參與蛋白質降解。F-box1能夠減少由MYB10驅動的花青素積累并干擾MBW復合物（圖7b，8a）。
此外，F-box1的過度表達導致MYB10-LUC融合蛋白的熒光素酶活性降低（圖8c）和MYB10蛋白降解（圖8d）。這些結果表明，F-box1通過泛素化途徑直接靶向MYB10蛋白降解。因此，miRNA靶點F-box1也可以通過蛋白質轉換影響MYB10。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 8
04
結論
獼猴桃果肉中花青素的外觀由兩種MYB激活劑MYB10（紅色內果皮）和MYB110（紅色全果肉）確定（圖9）。MYB10和MYB110可能起源于祖先的MYB，在基因復制后具有亞功能化。蛋白質C末端的兩個關鍵基序被表征并直接影響MYB活性的強度。MYB110被小RNA AcTAS4-D4（-）直接切割，由miR828觸發。MYB10被miRNA的基因靶標廣泛抑制，這些miRNA在外果皮中的表達低于內果皮，導致MYB11抑制。這項研究揭示了獼猴桃色素沉著的激活抑制系統。
?
編輯切換為居中
添加圖片注釋，不超過 140 字（可選）
Fig. 9
05
獲取原文
原文鏈接：
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18122
PDF獲取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-116.html#_np=107_423
文末附件.
賽思基因www.scientsgene.com致力于開發轉基因和基因編輯中的“硬核科技”，突破遺傳轉化中的基因型限制，輔助基因編輯育種。目前公司擁有國內數量最多的穩定遺傳轉化體系，包括但不限于油茶、花生、藜麥、大白菜、小白菜、辣椒、菜心、油菜、紫菜薹、櫻桃蘿卜、胡蘿卜、甘藍、抱子甘藍、寶塔菜、紫/黃/綠花椰菜、青花菜、西瓜、南瓜、甜瓜、茄子、梨樹、棗樹、大豆、棉花等遺傳轉化體系。
賽思基因可為廣大科研和育種工作者提供穩定的，非嵌合的，多品種的過表達、基因沉默株系和基因編輯突變體。期待與您的深入合作，共同推動中國種業的進步。
總結
以上是生活随笔為你收集整理的猕猴桃的红色果肉受到特定的激活-抑制系统的控制的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
- 上一篇： mysql的explain执行计划_My
- 下一篇： OA协同办公系统未来的趋势