在別人的電子書，你的電子書，都在bookdown一文中推薦過這一篇教程(https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course)，從2016年一直更新到2018年，是入門單細胞分析的十分適合的文檔。為了進一步促進學習，生信寶典申請并組織翻譯這篇教程，將在公眾號陸續推出。最后會有整合版以網頁和PDF格式發布于易生信平臺。

關于課程

采用高通量測序技術獲取單細胞水平的全轉錄組數據又稱scRNA-seq已應用越來越廣泛。scRNA-seq的優勢是其同時具有單細胞水平的分辨率和基因組范圍的檢測能力，可以解決其他方法如bulk RNA-seq或單細胞RT-qPCR解決不了的問題。然而，分析單細胞數據需要新的方法，以前用于bulk RNA-seq的一些計算方法的理論假設也不再適用。

在這個課程，我們討論scRNA-seq可以解決的問題，以及可用的計算和統計學方法。原版課程是劍橋大學生物信息培訓中心授課所用, 但文字版教材適用于任何對scRNA-seq分析感興趣的人。課程每年兩次，材料在開課前更新。

計算工具的數量增加很快，我們盡力更新至最新技術。這個課程的一個主要限制是我們傾向于使用在R里面實現并且速度相對快的工具 （其他語言實現的工具也通用，關鍵是理解原理）。另外，我們傾向于使用自己或朋友、同事開發的工具。(譯者注：無可厚非，一是更了解，二是更容易獲取幫助。我們也更傾向于使用自己的繪圖工具ImageGP。)

視頻

視頻課錄制于2017年11月，那時課程章節更少一些。視頻在Youtube上，https://www.youtube.com/embed/56n77bpjiKo?list=PLEyKDyF1qdOYAhwU71qlrOXYsYHtyIu8n。

GitHub

https://github.com/hemberg-lab/scRNA.seq.course

Docker 鏡像 (RStudio)

課程可以通過安裝了所有依賴包的RStudio的Docker鏡像重現。

確保你的電腦已安裝了Docker，如果沒有，請參照Docker基礎。運行下面命令啟動Docker鏡像：

docker run -d -p 8787:8787 quay.io/hemberg-group/scrna-seq-course-rstudio

這條命令會下載docker鏡像 (看網速快慢，需要一些時間)。下載完成后，會啟動Rstudio服務器版 (里面包含了依賴的程序包和數據)。

接下來就可以在基因組瀏覽器訪問localhost:8787，使用用戶名和密碼rstudio:rstudio登錄網頁版Rstudio (R語言學習 - 入門環境Rstudio)。

更多關于運行RStudio docker鏡像的選項見https://hub.docker.com/r/rocker/rstudio-stable/.

譯者注：如果您參加過我們的易生信課程，這些操作都應該比較熟悉了。需要注意的是：1. 確認8787端口有無被占用，尤其是自己在服務器運行過Rstudio server時。2. 如果服務器有外網IP，可以在任何電腦的瀏覽器輸入IP:8787訪問。

譯者注：如果不習慣Docker，或沒有管理員權限，自己在Windows下安裝依賴包也不費事。

手動安裝

如果不使用Docker鏡像，需要克隆或下載course GitHub repository并且在下載后的文件夾中啟動R session。并且需要安裝課程的docker文件: Dockerfile1 和 Dockerfile2中列出的所有包.

許可

所有課程材料遵循?GPL-3協議. 任何人都可以閱讀這份材料來學習scRNA-seq數據分析. 如果應用于教學，除了提供合適的引用外，還請聯系我們 (英文版：Vladimir Kiselev (vladimir.yu.kiselev@gmail.com)，中文版 易生信 train@ehbio.com。)。

課程基礎

課程適用于有Linux/Unix和R基礎的朋友 (藍字可點擊)。

另外，我們也假設您對常規轉錄組的比對和分析，以及常用的計算工具比較熟悉 （39個轉錄組分析工具，120種組合評估(轉錄組分析工具哪家強-導讀版)）。

否則，我們推薦先參加Introduction to RNA-seq and ChIP-seq data analysis 或 Analysis of high-throughput sequencing data with Bioconductor，然后再參加這個課程。

譯者注：生物信息程序基礎和常規轉錄組分析的中文版視頻課程見：易生信原創課程 (如果是微信公眾號，后臺回復?培訓獲取)。

聯系我們

如果您有任何?評論,?問題?或?建議?請跟我們聯系。(英文版：Vladimir Kiselev (vladimir.yu.kiselev@gmail.com)，中文版 易生信 train@ehbio.com。)。

單細胞RNA-seq簡介

混合RNA-seq

• 2000年末的重大技術突破，取代微陣列表達芯片被廣泛使用

• 通過混合大量細胞獲取足夠RNA用于建庫測序，來定量每個基因的平均表達水平

• 用于比較轉錄組，例如比較不同物種的同一組織樣本

• 量化整體表達特征，如疾病研究中的表達模式

• 研究異質系統方面還有力所不及之處，例如對早期發育的研究,復雜組織（大腦）的研究

• 在基因表達隨機性研究方面心有余而力不足

scRNA-seq

• 是一項由湯富酬等人在2009年首次發表的新技術。文章發表于Nature Method，測序了7個單細胞，兩個卵裂球，兩個野生型卵子，兩個Dicer敲除的卵 子，一個Ago2敲除的卵子。

• 這項技術在2013年被Nature評為年度技術,更簡便的操作流程和較低的測序成本促成單細胞技術的廣泛流行。2018年底，單細胞技術應用于胚胎發育追蹤評為Science年度突破。

• 檢測每個基因在大量細胞中的表達水平分布。

• 可以研究細胞類型特異性轉錄調控的新型生物問題，例如細胞類型鑒定，細胞應答的異質性，細胞表達的隨機性，細胞間基因調控網絡的推斷等

• 研究中細胞數目范圍從100個變到10^6個且每年遞增。

• 目前有許多不同的單細胞Protocol，例如?SMART-seq2?,?CELL-seq? 和?Drop-seq?。

• 還有商業平臺，包括 Fluidigm C1, Wafergen ICELL8和the 10X Genomics Chromium。

• Bulk RNA-seq技術中一些計算分析方法可應用于單細胞分析。

• 多數情況下單細胞計算分析需要調整現有方法或者開發新方法

工作流程

總體而言，scRNA-seq的實驗方案和bulk RNA-seq的相似。我們將在下一節一起討論一些最通用的方法。

計算分析

本課程內容是scRNA-seq實驗中得到的數據進行計算分析?？傮w流程如下圖所示，前面三步（黃色）對于任何高通量測序數據是通用的，緊隨其后的四步（橙色）是要將傳統RNA-Seq分析中已有的方法和新開發的方法結合起來解決scRNA-seq的技術差異問題，最后的部分（藍色）是使用專門為scRNA-seq開發的方法來進行生物分析解讀。

scRNA-seq分析的綜述有幾篇，包括?Computational and Analytical Challenges in Single-Cell Transcriptomics.”?Nat Rev Genet?16 (3) 。

目前還有其他平臺可以執行上述流程圖中的一步或多步操作：

• Falco：是一個單細胞RNA-seq的云處理平臺，更像是一個流程部署和管理工具，一年多未更新了，一般也用不上。能部署的應該都有自己 的一套部署工具，初學者不需要學這么復雜的。有精力，可以學習下其部署理念應用于自己的流程。

• SCONE（Single-Cell Overview of Normalized Expression）：單細胞RNA-seq質量控制和標準化的R包 (一年多沒更新了, Yosef研究 組2018年在Nature method發表一個單細胞分型的深度學習平臺，scVI，效果不錯，值得嘗試)

• Seurat ：單細胞質控，分析和數據探索而設計的R包，可以完成獲得定量數據后的幾乎所有分析。不少文章的幾個主圖都是來自這個軟件包 。這個軟件包可以作為學習的入門，官網的教程示例寫的很詳細。

• ASAP（Automated Single-cell Analysis Pipeline) ：是一款單細胞分析的交互式網絡平臺。從基因表達矩陣開始到后期分析。功能相對比較全，定制化弱一些。學完這份教程，里面的功能都可以自己實現。

挑戰

Bulk RNA-seq和scRNA-seq的主要差別是每個測序文庫代表一個單細胞還是一群細胞。比較不同細胞（不同測序文庫）的結果需要格外注意。文庫之間差異的主要來源是：

• 擴增效率和擴增偏好性（部分文庫可擴增多達100萬倍）

• 基因 ‘dropouts’: 基因在一個細胞中呈現中等表達水平,但在另一個細胞中未檢測到表達，這可能來源于scRNA-seq中RNA總量低導致的擴增建庫丟失或RNA表達的隨機性。

取自于單獨一個細胞的低轉錄本總量是這兩個文庫差異的一個主要原因。提高轉錄本捕獲效率和降低擴增偏好可以降低差異，是目前活躍的研究方向。從后續課程學習中也可以看 到，合適的標準化和校正方法也可以抵消一部分文庫構建引入的噪音。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（一）的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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